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Artículo Original

Estudio del polimorfismo del gen de TNF-α, de dicha citocina, y de MCP-1 en pacientes con queratopatía climática esferoidea

Horacio M Serra, María F Suárez, María C García Oro, Evangelina Espósito, Thamara A Cafaro, Rodolfo Monti, Julio A Zavalía-Urrets

ARCHIVOS DE ALERGIA E INMUNOLOGÍA CLÍNICA 2013;( 3):0090-0096 


Objetivo. Investigar polimorfismo de nucleótidos únicos (SNP) en la posición -308 (G/A) del gen TNF-α y la participación de las citocinas TNF-α y MCP-1 en pacientes con queratopatía climática esferoidea (QCE) y en controles sanos.
Materiales y métodos. Participaron 15 pacientes con QCE y 15 individuos sanos del departamento El Cuy, Provincia de Río Negro. Todos ellos, luego de firmar el consentimiento informado, recibieron un examen oftalmológico completo y se recolectaron muestras de sangre y lágrima para realizar diferentes estudios. EL ADN genómico fue obtenido de sangre de todos los individuos mediante el método de salting out y posteriormente amplificado y estudiado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el sistema de amplificación refractaria a la mutación (ARMS). También se investigaron concentraciones de algunas citocinas proinflamatorias en lágrimas y en sobrenadante de cultivo de células epiteliales corneales humanas (CECH) tratadas o no con radiación ultravioleta B (RUV-B).
Resultados. Los resultados de SNP en la posición -308 (G/A) del gen TNF-α (frecuencia alélica y genotípica) indicaron ausencia de diferencias significativas entre pacientes y controles sanos. Fenotípicamente ambos grupos de individuos serían bajos o intermedios productores in vitro de la citocina TNF-α. Sin embargo en las lágrimas de pacientes con QCE se detectaron concentraciones significativamente superiores de TNF-α, IL-1β y MCP-1 (citocinas proinflamatorias) que en lágrimas de individuos controles sanos (p<0,0001) En la periferia y limbo de la córnea las células dendríticas (CD) incrementaron significativamente con el progreso de la enfermedad (p<0,05). La contribución del epitelio corneal en el proceso inflamatorio fue investigada utilizando CECH expuestas o no a 10 mJ/cm2 de RUV-B. A pesar de la presencia de gelatinasas, IL-6 e IL-8 en sobrenadantes de cultivos obtenidos a las 48 horas (datos no mostrados) no observamos niveles detectables de TNF-α, IL-1β ni MCP-1.
Conclusión. Este trabajo aporta nuevos datos para aumentar los conocimientos sobre los mecanismos inmunológicos involucrados en la etiopatogenia y progresión de la QCE. Demostramos que las citocinas proinflamatorias MCP-1 y TNF-α están significativamente elevadas en lágrimas de individuos con QCE, como se observó previamente con IL-1β. MCP-1 sería la responsable del aumento de CD en córnea periférica y limbo de estos pacientes a medida de que la enfermedad avanza. El hallazgo de que estas citocinas no pudieron ser detectadas en cultivos de CECH estresadas con RUV-B implica que otras células son las responsables de su producción o que además de RUV-B otros factores son necesarios para iniciar esta cascada de eventos que se observan en esta hipersensibilidad corneal humana.


Palabras clave: hipersensibilidad, queratopatía, TNF-α, MCP-1, RUV-B.

Purpose. To investigate Single Nucleotide Polymorphism (SNP) at -308 position (G/A) of TNF-α gen and involving of TNF-α and MCP-1 cytokines in Climatic Droplet Keratopathy (CDK) patients and healthy controls.
Materials and methods. Fifteen patients with CDK and fifteen healthy controls from departamento El Cuy, province of Rio Negro were involved in this study. After informed consent was obtained from all participants, they had a complete eye examination and then tear and blood samples were collected to perform different assays. DNA was obtained from blood of all individuals using the method of “salting out” and then amplified and studied performing the polymerase chain reaction (PCR) with Amplification-refractory Mutation System (ARMS). Furthermore, some cytokines concentrations were measured in tears and supernatants from human corneal epithelial cells (HCEs) exposed or not to UVR-B radiation.
Results. Analysis from SNP at position -308 (G/A) of TNF-α gen (allelic and genotypic frequency) showed no significant differences between patients and healthy controls. Phenotypically both groups of individuals would be low or intermediate in vitro producers of TNF-α cytokine. However, in tears from CDK’s patients we detected significantly higher concentrations of TNF-α, IL-1β and MCP-1 (pro-inflammatory cytokines) than in healthy control subjects tears (p<0.0001). At the corneal peripheral / limbus area, dendritic cells (DCs) increased significantly with the progression of the disease (p<0.05). The corneal epithelium contribution to the inflammatory process was investigated using HCEs exposed or not to 10 mJ/cm2 of UV radiation–B (UVR-B). Despite the presence of gelatinases, IL-6 and IL-8 in culture supernatants obtained after 48 hours (data not shown), detectable levels of TNF-α, IL-1β and MCP-1 were not detected.
Conclusion. This study provides new insights to increase our knowledge about the immunological mechanisms involved in the etiopathogenesis and progression of CDK. We showed that pro-inflammatory cytokines MCP-1 y TNF-α were significantly increased in tears from CDK’s patients, as previously described with IL-1β. MCP-1 would be responsible for the increasing of DCs on the corneal peripheral / limbus area of these subjects as the disease progresses. The fact that these cytokines could not be detected in cultures of HCEs stressed with UVR-B implies that other cells are responsible for their production or, in addition to UVR-B, other factors are necessary to initiate the cascade of events observed in this human corneal hypersensitivity.


Keywords: hypersensitivity, keratopathy, TNF-α, MCP-1, UVR-B.


Los autores declaran no poseer conflictos de intereses. Premio AAAeIC al Mejor Trabajo de Investigación Clínica en Alergia – XXXVI Congreso Anual AAAeIC

Fuente de información Asociación Argentina de Alergia e Inmunología Clínica. Para solicitudes de reimpresión a Archivos de Alergia e Inmunología Clínica hacer click aquí.

Recibido | Aceptado | Publicado

Tabla 1. Frecuencias alélicas y genotípicas de polimorfismo del gen TNF-α en la posición −308...

Tabla 2. Niveles de citocinas (pg/ml/ng) en lágrimas de individuos con QCE y en controles sanos cu...

Introducción

 

En el año 1898 Baquis describió por primera vez una rara enfermedad de la córnea humana caracterizada por una marcada opacidad.1 Muchos años después se confirmaría que este velamiento progresivo ocurre en la capa de Bowman y en el estroma superficial.2-5 Desde entonces, muchas descripciones de esta enfermedad se han hecho en distintas partes del mundo, que tienen en común polvo y partículas en suspensión, clima seco y ventoso, e inapropiada protección ocular a RUV-B. 6-33

Esta enfermedad ha recibido diferentes denominaciones de acuerdo con la extensión y aspecto clínico del compromiso corneal, la naturaleza de los depósitos, el área geográfica de descripción, las actividades del paciente, por epónimo y por presunta etiología.34-47 Uno de los nombres usados para describir esta enfermedad es queratopatía climática esferoidea (QCE) la cual es una entidad clínica bien definida que no debe confundirse con secondary spheroidal degeneration, gelatinous drop-like dystrophy, edema corneal, band-shaped corneal degeneration, Salzmann´s nodular degeneration, climatic stromal proteoglycan keratopathy, Vogt limbal degeneration y distrofias corneales superficiales, tales como las de Reis-Buckler y granular, y la peripheral hypertrophic corneal degeneration.48

En adición a los hallazgos en la córnea, recientemente hemos notado que en pacientes con QCE son comunes las anormalidades en el iris.49

En los últimos siete años solamente nuestro grupo e investigadores japoneses de la Universidad de Tsukuba liderados por el Dr. N. Fujii han aportado nuevos resultados sobre QCE. Aunque los depósitos globulares en la porción más anterior de la córnea con QCE fueron descriptos ya hace muchos años usando microscopía óptica y electrónica,50,51 nosotros hemos estudiado anormalidades en QCE usando microscopía confocal láser de barrido in vivo (MCF). Con esta técnica ha sido posible obtener imágenes de diferentes capas de la córnea, clasificarlas, estimar su densidad celular y estudiar diferentes parámetros de los nervios.52-56 Aunque muchas degeneraciones corneales y distrofias han sido estudiadas con MCF, fuimos los primeros en describir anormalidades corneales encontradas en pacientes con QCE usando esta técnica.57 Imágenes de MCF mostraron que cambios iniciales en las capas superficiales no parecen afectar los plexos nerviosos, pero formaciones de depósitos posteriores conducen a cambios en los nervios sub-basales y estromales, los cuales son responsables de la hiposensibilidad corneal encontrada en estos pacientes.49 Las consecuencias patológicas en los nervios por acumulación de material extracelular pueden ser similares a la patogenia de la enfermedad Meretoja, en donde la acumulación anormal de gelsolina conduce a la destrucción de los nervios corneales.58

Como se mencionó anteriormente, muy poca investigación se ha llevado a cabo en el siglo pasado para tratar de elucidar los mecanismos moleculares involucrados en la patogenia de esta enfermedad. A pesar del hecho de que algunos constituyentes en los depósitos fueron identificados,59 su composición precisa es aún desconocida. Nosotros investigamos especímenes corneales con QCE parcialmente enriquecidos en depósitos anormales de proteínas, usando espectrometría de masas, e identificamos proteínas con función de unión celular, adhesión focal y regulación del citoesqueleto, lo que sugiere que varias de ellas podrían jugar un rol en la formación de depósitos.60

Hace algunos años, Fujii et al., usando un anticuerpo contra péptidos que contenía D-beta-Asp,61 demostraron la acumulación de proteínas que contienen D-beta-Asp en varias partes del ojo,62 y en tres especímenes con QCE.63 En un estudio previo ellos mostraron que los materiales amorfos encontrados en los mismos tres pacientes con QCE eran proteínas agregadas que contienen productos finales de glicosilación avanzada (AGE).64 Dado que todos estos cambios estructurales en las proteínas llevan a la acumulación de estas así como a su disfunción, los autores propusieron que en la patogenia de la QCE subyacen la formación y acumulación de AGE y proteínas con D-beta-Asp.

Recientemente nuestro grupo de investigación demostró un rol protagónico de ciertas citocinas proinflamatorias y gelatinasas en el desarrollo de la QCE. Los altos niveles de IL-1β e IL-8 en lágrimas de pacientes facilitan la producción de MMP-8 y gelatinasas, y los efectos de ellas se exacerban, ya que los pacientes tienen bajos niveles de sus inhibidores naturales (TIMP-1). La MMP-9, además de degradar componentes de la matriz extracelular, cataliza la activación postranscripcional de IL-1β, potenciando el proceso inflamatorio.65

Debido a que existe una importante participación de TNF-α en ciertos procesos de hipersensibilidad decidimos estudiar en este trabajo de investigación a esta citocina a nivel genético y proteico en pacientes que padecen de QCE. Además investigamos si MCP-1 participa en esta enfermedad.

 

Materiales y métodos

 

Individuos

Este estudio de investigación fue aprobado por el Consejo de Revisión Institucional de la Universidad Católica de Córdoba y por el Comité Institucional de Ética en Investigación de Salud del Ministerio de Salud de la Provincia de Córdoba, Argentina. El estudio se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki.

Se examinaron individuos con QCE (n=15) y controles sanos (n=15) del departamento El Cuy, en la provincia de Río Negro, Argentina, todos de sexo masculino y de un rango etario de 49-70 años.

 

Exámenes oftalmológicos

A todos los participantes del estudio se les explicó el trabajo de investigación, y aquellos que decidieron participar en él procedieron a firmar el consentimiento informado. Luego se les realizó un minucioso estudio de la córnea como se ha descrito anteriormente.49 A algunos pacientes con diferentes grados de QCE se les realizó MCF como se describe en la referencia.57

 

Muestra biológica

De todos los individuos se obtuvo lágrima (20 μl), utilizando un microcapilar descartable con la mínima irritación conjuntival posible y sin estimulación química o física; además se obtuvo 5 ml de sangre entera. Todas estas muestras fueron inmediatamente congeladas a –80ºC hasta el momento de su utilización para realizar diferentes estudios.

 

Ensayos

 

Extracción de ADN

Se obtuvo a partir de la sangre entera mediante el método descripto por Miller et al., denominado salting out.66

 

Genotipificación de TNF-α

Se realizó la genotipificación de TNF-α [-308 (G/A)]. Se utilizó el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el sistema de amplificación refractaria a la mutación (ARMS).67

 

Cultivo de células epiteliales corneales

Células epiteliales corneales humanas inmortalizadas con SV-40 (CECH) se cultivaron en medio D-MEM/F12 suplementado con 15% de suero fetal bovino, 5 mg/ml de insulina, 10 ng/ml de EGF humano, 1 mg/ml de glutamina, 40 g/ml de gentamicina (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) y 0,1 mg / ml de la toxina del cólera (Sigma, St. Louis, MO). Las células se sub cultivaron dos veces a la semana. CECH confluentes se lavaron una vez con PBS y la monocapa cubierta de PBS fue expuesto a RUV-B en recipientes de cultivo abiertos con energía de 10 mJ/cm2. Después de la estimulación con RUV-B, las células se incubaron durante 48 horas, se recogió el sobre nadante y se centrifugó 10 min a 400 g para eliminar las células flotantes. La monocapa celular se lavó con PBS frío y se lisaron en hielo para la medición de concentración total de proteínas. Todos los datos se normalizaron a la concentración de proteína del lisado celular.

 

Cuantificación de citocinas en lágrimas y en sobrenadante de cultivos de células epiteliales de córnea

Las citocinas IL-1β, TNF-α y MCP-1 fueron cuantificadas mediante un equipo comercial basado en ELISA (Bio-rad, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico de la expresión de TNF-α en el estudio del equilibrio de Hardy-Weinberg, se compararon las frecuencias observadas y esperadas por el test de χ2. El test de Fisher fue utilizado para estudiar asociaciones entre las frecuencias alélicas de los pacientes y los controles. El test de χ2 también fue utilizado para calcular la razón de ventaja (OR: odds ratio) y los valores p para comparar las frecuencias genotípicas y haplotípicas.

Los concentraciones de citocinas y las densidades de CD fueron evaluadas utilizando el test estadístico de Student y ANOVA, respectivamente, considerando una p<0,05 como estadísticamente significativa.

 

Resultados

 

Demografía

La edad media y rangos de los individuos de este estudio fueron, para pacientes y controles del departamento El Cuy, de 61,5 (53-70) años y 59,8 (49-68) años, respectivamente.

 

Estudios oftalmológicos

De los quince pacientes con QCE, siete presentaron grado 1, cinco grado 2, y tres individuos grado 3.

 

Presencia de CD en zonas periféricas

de la córnea

La MCF mostró que el número de CD en el área periférica/limbar de la córnea aumenta significativamente a medida que la enfermedad progresa. La densidad de CD en QCE grado 1 fue de 121±11 células/mm2; mientras que en los estadios moderado y avanzado (grados 2 y 3) las CD aumentaron a 178±14 células/mm2 y 264±13 células/mm2, respectivamente (p<0,05).

 

Genotipificación de TNF-α

Los resultados de SNP en la posición -308 (G/A) del gen TNF-α (frecuencias alélicas y genotípica) indicaron ausencia de diferencias significativas entre individuos con QCE y los controles sanos. Fenotípicamente ambos grupos de individuos serían bajos o intermedios productores in vitro de la citocina TNF-α (Tabla 1).

 

Cuantificación de citocinas en lágrimas

y sobrenadantes de cultivo de CECH

Se estudió y cuantificó si TNF-a y MCP-1 estaban presentes en el fluido lagrimal de pacientes y controles. Se cuantificó también IL-1β, a modo de control positivo, porque esta citocina pro-inflamatoria ya había mostrado niveles muy superiores en lágrimas de individuos con QCE en nuestro trabajo anterior utilizando otros pacientes65.

Como se puede observar en la Tabla 2, las concentraciones de TNF-a y MCP-1 fueron 10 y 6 veces mayores en las lágrimas de los pacientes con respecto a los controles sanos (p < 0,0001).

Con el objetivo de investigar el rol del epitelio corneal en el proceso inflamatorio expusimos CECH al estrés provocado por RUV-B (una de las múltiples condiciones ambientales desfavorables que padecen los individuos con QCE). Cuando estudiamos los sobrenadantes de cultivos 48 horas después de la exposición o no a 10 mJ/cm2 de RUV-B, no detectamos niveles de TNF-α, IL-1β ni MCP-1.

 

Discusión

 

Nuestro grupo ha descripto que la QCE tiene una alta incidencia en el departamento El Cuy en la provincia de Río Negro, que afecta a individuos cuya ocupación principal es el cuidado de ganado ovino a campo abierto durante gran parte del día y durante todo el año, y que han tenido una deficiencia nutricional importante de ácido ascórbico (AA) durante toda la vida. Esta región patagónica se caracteriza por un clima seco, ventoso, y suelo arenoso escasamente cubierto por arbustos pequeños (Tesis Doctoral del profesor Dr. Julio A. Urrets-Zavalía).

Recientemente hemos demostrado que en pacientes con QCE se produce una reacción de hipersensibilidad en la córnea en donde inicialmente participan componentes proinflamatorios muy importantes de la inmunidad.65

Debido a que estas personas están expuestas a un bombardeo sobre la córnea de partículas transportadas por el viento y tienen disminuidos los mecanismos protectores contra las RUV (no utilizan lentes de sol, ni sombrero, y tienen una disminución significativa de AA en la córnea), se produciría la degradación de proteínas extravasadas desde los vasos limbares y la acumulación progresiva en las capas superficiales (manuscrito en preparación).

En este trabajo continuamos con la investigación de otros componentes proinflamatorios de la inmunidad (TNF-α y MCP-1) en pacientes con QCE.

Existen muchísimas evidencias que le otorgan importancia a la asociación entre ciertas variantes alélicas de genes del complejo HLA y la susceptibilidad a múltiples enfermedades. Nosotros hemos estado estudiando posibles asociaciones entre ciertos genes HLA y QCE. En el cromosoma 6 humano, además de las regiones HLA-I y –II se encuentran genes que codifican citocinas tales como TNF-α y LT (HLA-III).

Las citocinas, que pueden ser proinflamatorias (TNF-α, IL-1β, IL-8, etc.) o antiinflamatorias (TGF-β, IL-10, etc.), son proteínas producidas por diferentes tipos celulares que ejercen distintos tipos de acciones sobre células que expresan receptores específicos de membrana para dichas moléculas. Se han observado polimorfismos de una o dos bases nucleotídicas en genes de varias de estas moléculas, los cuales están asociados a una mayor o menor producción de dichas proteínas in vitro.68,69 La cantidad de investigaciones que han demostrado asociación entre estos polimorfismos y diferentes enfermedades humanas es enorme y algunas de ellas pueden ser leídas en las siguientes revisiones.70-76

Con respecto al gen TNF-α, se ha identificado una transición G por A en la posición (-308) dentro de la región promotora, y los individuos portadores del alelo A son altos secretores de esta citocina.77,78

A pesar de que este polimorfismo ha sido asociado con ciertas enfermedades,79-81 nuestra investigación a nivel genético no demostró diferencias significativas en el polimorfismo simple de nucleótido (-308), ni en las frecuencias alélicas o genotípicas entre pacientes con QCE y controles sanos.

Si bien tanto pacientes como controles corresponden a un fenotipo caracterizado por una producción baja o intermedia de TNF-α, los individuos con QCE tuvieron concentraciones de esta citocina en lágrima 10 veces superiores a las encontradas en individuos sanos. Las lágrimas de estos pacientes también mostraron un incremento similar en los niveles de IL-1β con respecto a controles normales, dato que nos permite corroborar los resultados obtenidos con otra cohorte de pacientes en un trabajo previo.65 Los niveles aumentados de IL-1β son los responsables del significativo aumento de MMP-9 en los pacientes con QCE. La existencia de importantes concentraciones de TNF-α (Tabla 2) potenciarían la actividad de IL-1β up regulando la transcripción, traducción y actividad enzimática de MMP-9. Estos resultados concuerdan con las observaciones publicadas por Nee et al.82 utilizando células mesangiales glomerulares.

El aumento de IL-8, quimioatractante de neutrófilos (PMN), contribuye a la liberación por dichas células de elevados niveles de MMP-8 encontrados también en lágrima de pacientes. Es de interés resaltar que las diferencias significativas encontradas en este trabajo en las concentraciones de TNF-α en las lágrimas de pacientes con QCE vs. controles sanos podrían explicarse por la liberación de esta citocina por las células PMN.

Nuestros estudios de MCF demostraron que el número de CD presentes en la zona periférica/limbar en QCE es mayor que en córneas normales (datos no mostrados) y además aumenta de manera significativa a medida que la enfermedad progresa. Debido a que precursores de CD expresan el receptor para MCP-1 y nosotros encontramos un significativo aumento de esta quimiocina en lágrimas de pacientes (6 veces más que en individuos sanos), se podría inferir que esta quimiocina contribuye al reclutamiento y posterior diferenciación del elevado número de CD observados en esta región de la cornea. La acción de estas excelentes células fagocíticas explicaría la acumulación de los depósitos proteicos en la zona central y su ausencia en la zona periférica.

Debido a que hasta ahora no disponemos de un modelo experimental que reproduzca esta patología en el ser humano, decidimos investigar como responden células epiteliales de córnea humana en cultivo cuando son tratadas con dosis similares de RUV-B a las que están expuestos los individuos enfermos. En los sobrenadantes de CECH expuestas a 10 mJ/cm2 de RUV-B se detectó IL-8 (datos no mostrados), pero no observamos niveles detectables de TNF-α ni de MCP-1. Estos resultados no son contradictorios con lo anteriormente presentado sino que más bien indicarían que otras células corneales son las responsables de la producción de dichas moléculas, y que además de RUV-B otros factores están involucrados en la iniciación de esta cascada de eventos que se observan en esta hipersensibilidad corneal humana.

Este trabajo de investigación permitió profundizar el conocimiento sobre los complejos mecanismos que operan en la QCE y demostrar la participación de nuevas citocinas inflamatorias en el desarrollo de esta hipersensibilidad.

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Autores

Horacio M Serra
CIBICI, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba.
María F Suárez
CIBICI, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba.
María C García Oro
Laboratorio, Hospital Infantil Municipal Córdoba.
Evangelina Espósito
Centro de la Visión, Clínica Universitaria Reina Fabiola, Universidad Católica de Córdoba.
Thamara A Cafaro
CIBICI, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba.
Rodolfo Monti
Centro de la Visión, Clínica Universitaria Reina Fabiola, Universidad Católica de Córdoba.
Julio A Zavalía-Urrets
Centro de la Visión, Clínica Universitaria Reina Fabiola, Universidad Católica de Córdoba. Rep. Argentina.

Autor correspondencia

Horacio M Serra
CIBICI, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba.

Correo electrónico: alergofas@gmail.com

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Estudio del polimorfismo del gen de TNF-α, de dicha citocina, y de MCP-1 en pacientes con queratopatía climática esferoidea

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Archivos de Alergia e Inmunología Clínica , Volumen Año 2013 Num 3

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Titulo
Estudio del polimorfismo del gen de TNF-α, de dicha citocina, y de MCP-1 en pacientes con queratopatía climática esferoidea

Autores
Horacio M Serra, María F Suárez, María C García Oro, Evangelina Espósito, Thamara A Cafaro, Rodolfo Monti, Julio A Zavalía-Urrets

Publicación
Archivos de Alergia e Inmunología Clínica

Editor
Asociación Argentina de Alergia e Inmunología Clínica

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