Figura 1. Ecuación 1

Figura 2. Ecuación 2

Figura 3. Ecuación 3

Tabla 1. Péptidos no sobrelapados de 20 aminoácidos de la proteína MSP-5, y correspondientes sec...

Tabla 2. Péptidos no sobrelapados de 20 aminoácidos de la proteína MSP-6, y correspondientes sec...

Tabla 3. Primera secuencia teórica generada y sus correspondientes péptidos predichos de unión.

Tabla 4. Segunda secuencia teórica generada y sus correspondientes péptidos predichos de unión

Tabla 5. Tercera secuencia teórica generada y correspondientes péptidos predichos de unión.

Introducción

La probabilidad es una medida que permite cuantificar la ocurrencia de un evento en el futuro.1,2

La función de probabilidad fue definida por Kolmogorov como aquella que satisface tres axiomas fundamentales: la probabilidad de cualquier elemento del espacio muestral es mayor o igual a cero, la probabilidad del espacio muestral en su totalidad es uno, y la probabilidad de la unión de eventos disjuntos equivale a la suma de sus probabilidades.1-3

Por otra parte, el concepto de entropía atiende a varias interpretaciones.4-7 Los sistemas con una distribución equiprobable pueden ser descritos desde la formulación de Boltzmann, quien define la entropía en términos del número de microestados del sistema;4 la entropía de un macroestado es proporcional al logaritmo del número de microestados o configuraciones en las que este se puede presentar.

La teoría de la probabilidad y la enunciada formulación de entropía de Boltzmann han sido aplicadas para el desarrollo de una teoría de predicción de unión al HLA clase II,8 al ser estas secuencias representadas en términos de microestados y macroestados. En dicha teoría se aplican las teorías de la probabilidad, la combinatoria y la entropía, y al estudiar con base en ellas la distribución de grupos de aminoácidos, fue posible determinar como condición característica de los péptidos de unión ciertas repeticiones y condiciones específicas, estableciendo matemáticamente las diferencias entre péptidos de unión y de no unión para cualquier alelo. Esto se hizo a partir de un experimento mental en el que se imagina la posibilidad de que se encuentren nueve glicinas en la región central de unión del HLA clase II respecto de la totalidad de posibilidades, que son en total 209. Al comparar la probabilidad de aparición de este péptido imaginario respecto a péptidos reales de unión como el CLIP, y un péptido de no unión con todos sus péptidos diferentes, y que en conjunto engloban la totalidad de péptidos posibles, se hace posible representar el fenómeno de unión al HLA clase II en el lenguaje matemático de las probabilidades y posteriormente en el de la entropía de la mecánica estadística. Esta forma de cuantificar el fenómeno constituye el fundamento de la teoría predictiva desarrollada.8

Esta teoría fue aplicada posteriormente a la determinación de péptidos de unión al HLA clase II de otras proteínas,8 determinando péptidos de cada una que puedan ser útiles para el desarrollo de vacunas, y mejorando medidas de desempeño de los métodos de predicción actuales (Rodríguez J, et al. Theoretical binding prediction to HLA class II applied to HER2/neu and API m1. En revisión para publicación).

La determinación de la existencia de péptidos de las proteínas asociadas a la invasión del P. falciparum al eritrocito que puedan ser reconocidos por el HLA clase II es de vital importancia para encontrar posibles péptidos para el desarrollo de vacunas. Dentro del complejo de proteínas especializadas del antígeno leucocitario humano (HLA), el HLA clase II se ocupa de la presentación de péptidos a las células T CD4+;9 los péptidos varían en tamaño debido a que la hendidura de unión de las moléculas de HLA clase II se encuentra abierta en sus extremos, pero se ha encontrado que en la unión dada entre péptido y HLA clase II es fundamental únicamente una región conformada por nueve aminoácidos.10 Es así como en términos de la teoría de probabilidad, la región central puede definirse como compuesta por varios eventos probabilísticos;8 a partir de allí es posible cuantificar las diferentes secuencias de aminoácidos posibles y evaluar la probabilidad de la secuencia dentro del conjunto total de ellas. Paralelamente, los péptidos presentados por la región central son vistos análogamente a los macroestados y microestados en el contexto de la entropía.8

En el ámbito de la salud pública, la malaria es una enfermedad que representa actualmente uno de los mayores problemas a nivel mundial, con reportes de aproximadamente 500 millones de afectados al año y siendo causante de tres millones de muertes tan sólo en África.11,12 Esto ha conducido a la realización de múltiples trabajos, en los que con el fin de desarrollar vacunas, se busca definir las interacciones específicas ligando–receptor inherentes al proceso de la invasión de los parásitos de la malaria.13 Las proteínas de superficie del merozoíto (MSP) son un grupo de proteínas de gran importancia en dicho proceso, dado que los anticuerpos contra ellas pueden bloquear la invasión del merozoíto a los glóbulos rojos. La proteína MSP-5 se encuentra en la superficie del trofozoíto y en merozoítos libres; el gen en que se codifica esta molécula está localizado en el cromosoma 2 del Plasmodium falciparum.14,15 Pese a su papel en la inmunización de ratones al P. falciparum y P. yoelii,16 algunos estudios cuestionan su rol en la invasión.17 La proteína de superficie MSP-6 forma un complejo en la superficie del merozoíto junto con las proteínas MSP-1 y MSP-7, el cual es liberado del parásito cerca del momento de la invasión al eritrocito.18,19 Aunque la función de la proteína MSP-6 aún es desconocida, esta puede estar involucrada en la invasión y puede ser un candidato para el desarrollo de vacunas, pues los individuos infectados con P. falciparum presentan anticuerpos reactivos contra MSP-6.20

El propósito de esta investigación es aplicar la teoría de predicción de unión de péptidos a la región central del HLA clase II,8 a los péptidos nonámeros sobrelapados de las secuencias de 20 aminoácidos no sobrelapados de las proteínas de superficie MSP-5 y MSP-6, además de aplicar la metodología a la determinación de la totalidad de péptidos predichos de unión para tres proteínas teóricas compuestas por 500 aminoácidos cada una.

Definiciones

Macroestado: existen dos macroestados, el de unión y el de no unión, constituidos por el conjunto de secuencias que tengan los valores predichos de unión o no unión, respectivamente, de acuerdo con la metodología planteada.8

Microestado: cualquier secuencia nonámera particular.8

Tipo de secuencia: microestados que al ser evaluados con la metodología descrita presenten el mismo valor en su combinatoria y en los criterios definidos.8

Probabilidad laplaciana: es utilizada para establecer la probabilidad de un tipo de secuencia A, y se define como la cantidad de microestados NA asociados a este tipo de secuencia dividida entre el total de posibles microestados N:4

Ecuación 1

Ley combinatoria para determinar la cantidad de microestados ω: siguiendo la metodología planteada,8 cada péptido tiene asociado un número de posibles microestados de acuerdo con los aminoácidos que presente en cada posición. Para determinar el número de microestados asociados a un tipo de secuencia, los valores asociados a cada posición se multiplican. Estos valores dependen del número de posibles aminoácidos asociados a cada lugar, los cuales a su vez se establecen con base en el grupo al que pertenezcan y sus repeticiones en el tipo de secuencia, de acuerdo con las tablas de criterios evaluadores y tablas de grupos de aminoácidos de la teoría realizada.8

Entropía: para un sistema equiprobable la entropía se define de acuerdo con la siguiente ecuación:

Ecuación 2

Donde k es igual a la constante de Boltzmann, 1,38×10–23 (J/k), ω representa los posibles microestados y S es el valor de la entropía.4-6

Proporción S/k: mediante el despeje de la anterior ecuación se obtiene:

Ecuación 3

Material y método

Las proteínas de superficie MSP-5 y MSP-6 fueron divididas en secuencias de 20 aminoácidos, determinando los péptidos nonámeros sobrelapados incluidos en cada secuencia. Para ello se toman nueve aminoácidos consecutivos comenzando desde el péptido uno de la secuencia, después se toman nueve aminoácidos consecutivos comenzando desde el péptido dos, y así consecutivamente, hasta completar los 12 péptidos nonámeros sobrelapados de cada secuencia de 20 aminoácidos. Adicionalmente, se identificaron los péptidos nonámeros sobrelapados de tres proteínas teóricas compuestas por 500 aminoácidos cada una. Seguidamente se aplicó la metodología desarrollada por Rodríguez8 para determinar la pertenencia de las secuencias sobrelapadas al macroestado de unión o de no unión.

El procedimiento consiste en la realización de cuatro pasos, en donde se agrupan los 20 aminoácidos de forma específica, el procedimiento de cálculo para los pasos uno y tres es asignar a cada posición un número según el aminoácido encontrado en cada lugar dependiendo del conjunto en el que se encuentre, de acuerdo con los parámetros establecidos en la formulación de la teoría;8 posteriormente, para calcular la probabilidad laplaciana de un tipo de secuencia en los pasos 2 y 4 –véase Definiciones–, se multiplican dichos valores hallando el número de microestados asociados al tipo de secuencia.8 Partiendo del número de microestados posibles se realizaron los cálculos de entropía para cada tipo de secuencia aplicando la ecuación de Boltzmann –Ecuación 2–. Con base en la proporción S/k, –Ecuación 3–, y de los rangos mínimos y máximos asociados a los péptidos de alta unión, se efectúa el cálculo para la predicción teórica, determinando si el valor de entropía se encuentra o no dentro de los rangos predichos de unión; según la teoría desarrollada,8 las secuencias nonámeras con proporciones S/k entre 8,55 y 12,8 para los primeros pasos y entre 6,98 y 10,5 para los últimos pasos son predichas de unión al HLA clase II.

Resultados

A partir de los péptidos de 20 aminoácidos analizados de MSP-5, se determinaron 168 secuencias peptídicas nonámeras, y se encontraron 31 secuencias nonámeras que corresponden al macroestado de unión, mientras que 137 corresponden al macroestado de no unión (Tabla 1). De los 228 péptidos analizados para MSP-6, se encontraron 35 secuencias nonámeras que corresponden al macroestado de unión, mientras que 193 corresponden al macroestado de no unión (Tabla 2). Las proporciones S/k de los péptidos asociados al macroestado de unión oscilaron entre 7,09 y 10,49 para MSP-5 y entre 7,31 y 10,08 para MSP-6 (Tablas 1 y 2).

Para los 492 péptidos analizados en cada una de las proteínas teóricas, se encontró que 100, 111, y 91 corresponden, respectivamente, al macroestado de unión de cada una, mientras que las restantes 392, 381 y 401, respectivamente, corresponden al macroestado de no unión. En las Tablas 3, 4 y 5 se observa cada una de las secuencias teóricas construidas computacionalmente y sus respectivas secuencias nonámeras predichas como asociadas al macroestado de unión. El porcentaje de péptidos de unión respecto a la totalidad corresponde al 20,32% para la secuencia teórica 1, al 22,56% para la secuencia 2 y al 18,49% para la 3.

Discusión

Este es el primer trabajo donde se realiza una predicción de la totalidad de péptidos nonámeros de las proteínas de superficie MSP-5 y MSP-6 que pueden unirse a la región central de unión del HLA clase II con base en una teoría basada en las leyes de probabilidad, combinatoria y entropía. Se determinó la existencia de 32 secuencias nonámeras que corresponden al macroestado de unión para la proteína MSP-5, y 35 secuencias para la proteína MSP-6. Adicionalmente se determinó la totalidad de secuencias predichas de unión al HLA clase II de tres proteínas teóricas construidas computacionalmente, encontrando respectivamente 100, 111 y 91 secuencias asociadas al macroestado de unión. Dado el alto grado de especificidad que caracteriza el fenómeno de unión, la predicción de péptidos de las diferentes proteínas del merozoíto que se unen al HLA clase II mediante la aplicación de teorías físicas y matemáticas es útil para el desarrollo de vacunas.

Algunos trabajos realizados en predicción de unión de péptidos a partir de métodos basados en redes neuronales artificiales (ANN: artificial neural networks), programación lineal o vectores de máquina efectúan cuantificaciones de la unión de péptidos al HLA,21-23 y buscan patrones de unión caracterizando las posiciones y sus respectivos motivos; de este modo, la muestra usada limita la generalización, lo que significa que es posible, aun cuando sea improbable, que existan péptidos de unión sin motivos experimentales de unión. Contrario a lo sucedido con tales metodologías, la teoría base de este trabajo busca cuantificar la totalidad de péptidos de unión y no unión existentes independientemente de la especificidad alélica a partir de teorías físicas y matemáticas, con el objetivo de minimizar el esfuerzo, tiempo y costos implicados en la búsqueda de péptidos de unión únicamente desde pruebas de ensayo y error realizadas mediante metodologías experimentales.24 Sin embargo, dada la magnitud de las dificultades inherentes a este tipo de predicción, incluso con modelos que basados en la compilación exhaustiva de información, como los modelos de redes neurales, es necesario mejorar la presente teoría y confirmar sus resultados empíricamente con el fin de establecer el alcance de su utilidad en el desarrollo de vacunas.

A pesar de las múltiples dificultades inherentes para lograr una predicción efectiva, esta es la única teoría desarrollada que podría prever cómo buscar péptidos útiles para el desarrollo de vacunas que se unan a todas las personas de una población independientemente de la especificidad alélica, mediante la realización de cambios en los aminoácidos de secuencias específicas de acuerdo con la variabilidad de los alelos.

Se ha encontrado que la pérdida de energía de unión tiene una relación con la disminución del tamaño del péptido asociado a la molécula de HLA clase II según los estudios experimentales; adicionalmente se da una compensación a la pérdida que puede ser suministrada por la adición de aminoácidos en posiciones de anclaje, según lo muestran las interacciones de la región central.25 De este modo, a partir de la teoría desarrollada, se sugiere buscar péptidos útiles en el desarrollo de vacunas, e introducir aminoácidos basados en los cambios de los valores de los microestados, para luego realizar las pruebas experimentales. Anteriormente se ha aplicado la teoría desarrollada para la predicción de unión de péptidos de otras proteínas, tales como las proteínas MSA-2 y AMA-1, encontrando 35 posibles péptidos de unión para la proteína MSA-2 y 60 para la proteína AMA-1.8 Estos resultados pueden ser de beneficio en la selección de péptidos útiles para el diseño de vacunas contra la malaria.

La teoría desarrollada y su aplicación revelan un orden físico y matemático subyacente al fenómeno de unión que puede ser evaluado teóricamente, lo que hace innecesario el uso de grandes muestras experimentales.26 Esta perspectiva física acausal evidencia resultados de importancia en las áreas de biología molecular e inmunología, como por ejemplo en la caracterización realizada del repertorio T.27 En biología molecular se desarrolló recientemente una teoría predictiva de unión de péptidos de malaria al glóbulo rojo a partir de la teoría de la probabilidad, obteniendo resultados predictivos con una sensibilidad del 95% y una especificidad del 90% al compararse con los obtenidos experimentalmente.28

Dentro de los resultados en otros campos de la medicina a partir de esta concepción acausal, se encuentra un método diagnóstico de aplicación clínica para el Holter a partir de la teoría de los sistemas dinámicos y la determinación de órdenes de proporciones geométricos con base en la entropía,29 así como también la generalización teórica de arterias coronarias a partir de dimensiones fractales y el concepto de armonía matemática intrínseca,30 trabajo en el que se encontró un total de 60.249 posibles prototipos arteriales. Adicionalmente, este tipo de concepción ha sido base para el desarrollo de métodos predictivos de epidemias, por ejemplo para la dinámica anual de la malaria en Colombia, en el que se desarrolló una predicción con 100% de acierto a partir del análisis probabilista de rangos de infectados.31 Adicionalmente, el análisis de la dinámica de malaria en todos los municipios de Colombia mediante una aplicación de la ley de entropía permitió realizar predicciones matemáticas semanales para el establecimiento de la aparición de brotes.32 Estos trabajos y los anteriormente mencionados en inmunología, particularmente los referidos a la caracterización y predicción del fenómeno de unión de proteínas de la malaria, permiten el hallazgo efectivo de resultados cuantificables, objetivos y reproducibles, cuya aplicabilidad puede agilizar los procedimientos empleados actualmente, especialmente para el desarrollo de vacunas.

Dedicatoria

A los niños de Colombia.

Agradecimientos

Al Centro de Investigaciones de la Clínica del Country por su apoyo a nuestras investigaciones.

1. Laplace P. Ensayo filosófico sobre las probabilidades. Barcelona: Altaya; 1995.

2. Feynman RP, Leighton RB, Sands M. Probabilidad. En: Feynman RP, Leighton RB, Sands M. Física. Wilmington: Addison-Wesley Iberoamericana S.A.; 1998. pp. 6.1-6.16.

3. Mood A, Graybill F, Boes D. Introduction to the theory of statistics. 3ª edición. Singapore: Mc. Graw Hill; 1974.

4. Feynman RP, Leighton RB, Sands M. Leyes de la Termodinámica. En: Feynman RP, Leighton RB, Sands M. Física. Wilmington: Addison-Wesley Iberoamericana S.A.; 1964. Vol. 1, pp. 44.1-44.19.

5. Matvéev A. Física molecular. Moscú: MIR; 1987.

6. Tolman R. Principles of statistical mechanics. New York: Dover Publications; 1979.

7. Shannon C. The mathematical theory of communication. Chicago: University of Illinois Press; 1980.

8. Rodríguez J, Bernal P, Correa C, Prieto S, Benítez L, Vitery S, et al. Predicción de unión de péptidos de MSA-2 y AMA-1 de Plasmodium falciparum al HLA clase II. Inmunología 2009;28(3):115-124.

9. Wang JH, Reinherz E. Structural basis of T-cell recognition of peptides bound to MHC molecules. Mol Immunol 2001;38:1039-1049.

10. Rammennsee HG, Friede T, Stevanovic S. MHC ligands and peptide motifs: first listing. Immunogenetics 1995;41:178-228.

11. WHO. Data World malaria report. Hallado en: http://www.who.int/malaria/wmr2008/malaria2008.pdf.

12. Instituto Nacional de Salud. Así vamos en salud. Hallado en: http://www.asivamosensalud.org/index.php?option=com_content&view=article&id=93:%C3%8Dndic <http://www.asivamosensalud.org/index.php?option=com_content&view=article&id=93:Índic>e%20parasitario%20anual%20de%20malaria&catid=55:Indicadores&Itemid=74).

13. Cowman A, Crabb B. Invasion of red blood cells by malaria parasites. Cell 2006; 124:755-766.

14. Marshall VM, Tieqiao W, Coppel RL. Close linkage of three merozoite surface protein genes on chrom,osome 2 of Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol 1998;94:13-25.

15. Black CG, Wang L, Hibbs AR, Werner E, Coppel RL. Identification of the Plasmodium chabaudi homologue of merozoite surface proteins 4 and 5 of Plasmodium falciparum. Infect Immun 1999;67:2075-2081.

16. Goschnick MW, Black CG, Kedzierski L, et al. Merozoite surface protein 4/5 provides protection against lethal challenge with a heterologous malaria parasite strain. Infect Immun 2004;72:5840-5849.

17. Sanders Pr, Kats LM, Drew DR, O’Donnell RA, O’Neill M, Maier AG, et al. A set of glycosylphosphatidyl inositol-anchored membrane proteins of Plasmodium falciparum is refractory to genetic deletion. Infect Immun 2006;74:4330-4338.

18. Trucco C, Fernández-Reyes D, Howell S, Stafford WH, Set al. The merozoite surface protein 6 gene codes for a 36 kDa protein associated with the Plasmodium falciparum merozoite surface protein-1 complex. Mol Biochem Parasitol 2001;112:9-101.

19. Pearce JA, Triglia T, Hodder AN, Jackson DC, Cowman AF, Anders RF, et al. Plasmodium falciparum merozoite surface protein 6 is a dimorphic antigen. Infect Immun 2004;72:2321-2328.

20. Singh S, Soe S, Roussilhon C, Corradin G, Druilhe P. Plasmodium falciparum merozoite surface protein 6 displaysmultiple targets for naturally occurring antibodies that mediate monocyte-dependent parasite killing. Infect Immun 2005; 73:1235-1238.

21. Nielsen M, Lundegaard C, Worning P, Sylvester S, Lamberth K, Buus S, et al. Improved prediction of MHC class I and II epitopes using a novel Gibbs sampling approach. Bioinformatics 2004;20:1388-1397.

22. Southwood S, Sidney J, Kondo A, del Guercio MF, Appella E, Hoffman S, et al. Several common HLA-DR types share largely overlapping peptide binding repertoires. J Immunol 1998;160:3363-3373.

23. Brusic V, Rudy G, Honeyman M, Hammer J, Harrison L. Prediction of MHC class II-binding peptides using an evolutionary algorithm and artificial neural network. Bioinformatics 1998;14:121-130.

24. Meister GE, Roberts CGP, Berzofsky JA, De Groot AS. Two novel T cell epitope prediction algorithms based on MHC-binding motifs; comparison of predicted and published epitopes from Mycobacterium tuberculosis and HIV protein sequences. Vaccine 1995;13:581-591.

25. Sinigaglia F, Hammer J. Motifs and supermotifs for MHC class II binding peptides. J.Exp Med 1995;181:449-451.

26. Fernández-Rañada A. Introducción. En: Fernández-Rañada A, editor. Orden y caos. Barcelona: Prensa científica; 1990.

27. Rodríguez J. Comportamiento fractal del repertorio T específico contra el alérgeno Poa p9. Rev Fac Med Univ Nac Colomb 2005;53(2):72-78.

28. Rodríguez J, Bernal P, Prieto S, Correa C. Teoría de péptidos de alta unión de malaria al glóbulo rojo. Predicciones teóricas de nuevos péptidos de unión y mutaciones teóricas predictivas de aminoácidos críticos. Inmunología 2010;29(1):7-19.

29. Rodríguez J. Entropía proporcional de los sistemas dinámicos cardiacos. Predicciones físicas y matemáticas de la dinámica cardiaca de aplicación clínica. Rev Col Cardiol. 2010;17(3):115-129.

30. Rodríguez J, Prieto S, Correa C, Bernal P, Puerta G, Vitery S, et al. Theoretical generalization of normal and sick coronary arteries with fractal dimensions and the arterial intrinsic mathematical harmony. BMC Med Phys 2010;10:1-6. http://www.biomedcentral.com/1756-6649/10/1

31. Rodríguez J. Dinámica probabilista temporal de la epidemia de malaria en Colombia. Rev Fac Med 2009;17(2):214-222.

32. Rodríguez J. Método para la predicción de la dinámica temporal de la malaria en los municipios de Colombia. Rev Panam Salud Pública 2010;27(3):211-8.

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Predicción de unión de péptidos de Plasmodium falciparum al HLA clase II. Probabilidad, combinatoria y entropía aplicadas a las proteínas MSP-5 y MSP-6

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