Figura 1. Folato y B12 en la metilación y ciclo de un carbono. 5mC: 5-metilcitosina; 5-MTHF: 5-meti...

Figura 2. Estructura básica de los flavonoides.

Figura 3. Imágenes de la conformación cristalizada de FAD en MRHFr (6fcx, izquierda) y la obtenida...

Figura 4. Conformación de FAD unido a MTHFr en 6fcx (izquierda) y en la misma estructura luego de l...

Figura 5. Conformaciones de FAD unido a MTHFr, proteína en naranja 6fcx (cristal), en cian modelo p...

Figura 6. Conformaciones óptimas de interacción entre FAD con conformación presente en 6fcx y MTH...

Figura 7. Conformaciones obtenidas de ensayos de unión empleando como receptor los modelos estructu...

Figura 8. Conformaciones obtenidas de ensayos de unión empleando como receptor los modelos estructu...

Tabla 1. Energías de máxima probabilidad de unión ligando-proteína receptora (Kcal/mol)

Introducción

Asma y alergia

Diversos estudios científicos han demostrado que el asma es una enfermedad crónica multifactorial, con una importante base genética y ambiental. La exposición a alérgenos, contaminantes y factores ambientales puede inducir modificaciones epigenéticas, como la metilación del ADN en genes relacionados con la respuesta inmunológica, lo que influye en el desarrollo y severidad del asma y otras enfermedades alérgicas. Por ejemplo, se ha observado que la exposición prenatal a contaminantes ambientales como hidrocarburos aromáticos policíclicos puede alterar la metilación de genes como ACSL3, aumentando el riesgo de asma en la infancia. Además, la metilación de promotores de genes como TSLP se asocia a la exposición prenatal al tabaco y a la dermatitis atópica, y existen cientos de regiones metiladas asociadas con asma infantil1. Por otro lado, el asma presenta una gran heterogeneidad clínica y biológica, con diferentes fenotipos, como el asma neutrofílica, donde la inflamación está mediada principalmente por neutrófilos y citoquinas como la IL-17.

Relación entre MTHFR, asma y alergia

Aunque la literatura específica sobre la relación directa entre las variantes de MTHFR y el asma o las alergias es limitada en los trabajos revisados, se reportó que marcadores de deficiencia de folato se asociaron con dificultades respiratorias comunicadas por el paciente, con diagnóstico médico de asma y dificultad para respirar, pero no con la función pulmonar o la atopia2. El polimorfismo del gen MTHFR se asocia con la susceptibilidad al asma y la eficacia de los GC en niños. Los niños portadores de genotipos TT/CT presentan un mayor riesgo de desarrollar asma, y aquellos con genotipo TT son más sensibles al tratamiento con GC3. La ingesta elevada de donantes de metilo en la dieta se asoció con una reducción del riesgo de atopia y síntomas de asma. Esto podría tener efectos aditivos relacionados con los alelos de susceptibilidad del gen MTHFR. Las implicaciones clínicas requieren evaluación4. En ratones se ha observado que los animales deficientes en MTHFR homocigotas para A222V (677C>T) sobrevivieron más tiempo a la malaria experimental y los ratones que sobreexpresaron la enzima salvaje murieron antes en comparación con sus compañeros de camada de tipo salvaje5.

Metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR)

La MTHFR es una enzima clave en el ciclo del folato, responsable de la conversión de 5,10-metilentetrahidrofolato a 5-metiltetrahidrofolato, esencial para la remetilación de homocisteína a metionina Figura 1. La deficiencia grave de MTHFR es una enfermedad recesiva poco frecuente que causa hiperhomocisteinemia, homocisteinuria y afectación neurológica progresiva. Se han identificado más de 50 mutaciones en el gen MTHFR, y los casos graves pueden manifestarse en las primeras semanas de vida, con consecuencias letales si no se diagnostican y tratan precozmente. El tratamiento temprano con vitaminas del grupo B y betaína puede mejorar el pronóstico en pacientes diagnosticados de forma prenatal7. La MTHFR humana es una proteína homodimérica de aproximadamente 150 kDa, donde cada subunidad contiene un dominio catalítico N-terminal que une el cofactor FAD (flavín adenín dinucleótido) y un dominio regulador C-terminal que une S-adenosilmetionina (SAM)8. El dominio catalítico N-terminal (residuos 1-356) adopta un plegamiento similar al de otras oxidorreductasas dependientes de flavina, con un sitio activo que forma una hendidura donde se une el 5,10-metilentetrahidrofolato. El cofactor FAD se encuentra profundamente incrustado en el núcleo de este dominio y participa directamente en la transferencia de electrones durante la reacción enzimática9. La MTHFR cataliza la reducción de 5,10-metilentetrahidrofolato a 5-metiltetrahidrofolato utilizando NADPH como donador de electrones (Selhub, 1999). El mecanismo catalítico involucra varios pasos: unión del NADPH al sitio activo de la enzima, transferencia de un hidruro desde NADPH al FAD, reduciendo este cofactor, transferencia de electrones desde el FADH₂ al 5,10-metilentetrahidrofolato, iberación del producto 5-metiltetrahidrofolato. Esta reacción es irreversible y constituye un punto regulatorio crítico en el ciclo del folato, controlando la disponibilidad de 5-metiltetrahidrofolato para la síntesis de metionina y, consecuentemente, la producción de SAM, el principal donador de grupos metilo en el organismo10.

Estructura y propiedades
de los flavonoides

Los flavonoides constituyen un amplio grupo de compuestos polifenólicos presentes en plantas con reconocidas propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y anticancerígenas. Se caracterizan por un esqueleto básico de 15 carbonos (C6-C3-C6) que consiste en dos anillos aromáticos (A y B) unidos por un anillo heterocíclico oxigenado (C) (Figura 2). Basándose en variaciones en este anillo C y en los patrones de hidroxilación, los flavonoides se clasifican en varias subclases: Flavonas (apigenina, luteolina), Flavonoles (quercetina, kaempferol, miricetina), Flavanonas (naringenina, hesperetina), Flavan-3-oles (catequina, epicatequina), Antocianidinas (cianidina, delfinidina), Isoflavonas (genisteína, daidzeína). Recientes investigaciones han explorado la capacidad de estos compuestos para interactuar con diversas enzimas, incluyendo MTHFR, lo que abre nuevas perspectivas terapéuticas y nutricionales (Yeter et al., 2019). Los estudios in silico han proporcionado información valiosa sobre la interacción flavonoide-MTHFR (Yeter et al., 2019). Las simulaciones de acoplamiento molecular han identificado flavonoides específicos con alta afinidad por la enzima. La quercetina muestra una significativa afinidad por el sitio catalítico de MTHFR, con energías de unión predichas en el rango de -8.5 a -9.2 kcal/mol.

Este ensayo analiza la interacción ligando-receptor entre FAD, MTHF, naringina (NGN), Naringenina (NRGNN) y la enzima MTHFR, explorando los mecanismos moleculares subyacentes.

Materiales y métodos

Proteínas/Macromoléculas

La estructura de la metilentetrahidrofolato reductasa humana se obtuvo de RSCB PDB (https://www.rcsb.org/, 6fcx) y la de sus variantes A222V y la R157Q se modelaron a partir de sus secuencias fasta en el espacio de trabajo de Swiss Model12. Los modelos obtenidos se contrastaron con los producidos por el servidor Alpha Fold13 que también permite obtener modelos de la macromoléculas y sus ligando típicos, en este caso FAD para corroborar las poses de los ligandos en los ensayos de unión in silico (docking).

Análisis de ligandos

La estructura tridimensional (3D) de FAD, metlentetrahidrofolato, naringina, Naringenina y genisteína se obtuvieron de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). PubChem14 es un repositorio de sustancias químicas y actividades biológicas que consta de tres bases de datos: de sustancias, compuestos y bioensayos.

Ensayos de docking

El estudio de acoplamiento se llevó a cabo en tres etapas. Inicialmente se etudio la afinidad de la MTHFr normal y las variantes por sus ligandos naturales FAD. MTHF, y los flavonides naringina y su derivado Naringenina. En estos ensayos no se considera el ambiente de interacción sino solamente la afinidad entre la proteína y los ligandos. Se utilizó la versión para ordenador y la versión web de autodock vina, 1.2.5 15 en SwissDock. Posteriormente se determinó compatibilidad estructural entre ligando y receptor, para lo cual se recurrió a DiffDock, Gnina y Diffdock-L16, software que ensaya la complementariedad con inteligencia artificial entrenada con estructuras cristalográficas depositadas en RSCB PDB y Uniprot. Al contrario del ensayo anterior, estos protocolos no evalúan la afinidad sino solamente la geometría de los ligandos y de la cavidad o nicho que ocupa. Se obtiene así un rango de posiciones en que las puntuaciones positivas son las más semejantes a las que se dan naturalmente y las puntuaciones negativas, aunque coincidan con las conformaciones naturales, son menos probables. A continuación, se hicieron ensayos de competencia por la unión entre ligandos propios que interaccionan en el sitio activo de la enzima, FAD y MTHF y entre FAD y Naringina. Finalmente se determinaron las energías de unión de MTHF, NGN y NRGNN a la enzima con FAD previamente unido con el software AC.2.0 (attracting caviites, servidor de SwissDock) uno de los dos que considera la presencia de un ligando preexistente. Se lo eligió por su facilidad de carga de datos y velocidad de cálculo. Las imágenes correspondientes a los distintos arreglos se obtuvieron con Chimera 1.7.5.

Resultados y discusión

Los ensayos de afinidad se basan en las energías (ΔG, kcal/mol) de interacciones polares y no polares. La unión es más afín cuanto más negativo sea el valor. Como se puede observar en la Tabla 1 las variantes presentaron más afinidad para todos los ligandos al ensayar cada uno por separado. Este resultado parece contradictorio dada la evidencia experimental y clínica de un déficit de actividad en el caso de las variantes. Las estructuras que se obtienen por difracción de rayos X se logran por un procedimiento que asegura que el complejo proteína ligando se encuentre en un estado de mínima energía. Entonces es esperable que, si los cálculos de afinidad son correctos, den como resultado una predicción de pose del ligando muy aproximada, aunque no exacta a las poses en el cristal. Hasta el momento solo hay depositado para la enzima humana una única entidad que cristalizó solamente con FAD. No hay para esta enzima cristales con MTHF o con ambos ligandos, por lo que se desconoce el ordenamiento intramolecular con ambos ligandos. Si existen enzimas de otros organismos, que carecen de dominio regulatorio, cristalizadas con metiltetrahidrofolato o dimetiltetrahidrofolato. Los ensayos de unión (docking) entre la estructura de la variante normal y dos variantes patológicas que producen déficit de actividad mostraron que la afinidad por los ligandos es mayor en las últimas (Tabla 1), lo que resulta contradictorio a primera vista. Al contrastar los resultados con la imagen digitalizada obtenida por difracción de rayos X y por criomicroscopia electrónica de resolución atómica del cristal de MTHFr humana 6fcx, se aprecia claramente que todas las poses (conformaciones) del ligando más afín, FAD, estaban alejadas de la que se observa en el cristal (ej. Figura 3). El problema que surge es que los cálculos son correctos pero el resultado no coincide con los datos experimentales. Por otra parte, eso explicaría la discordancia entre los informes de menor actividad para las variantes y su mayor afinidad.

Se recurrió a DiffDock, y se reevaluó la interacción MTHFr –FAD. Este software desconoce todo lo relativo a la química de unión, pero optimiza por inteligencia artificial la conformación del ligando tomando en cuenta su movilidad y su geometría, así como la de la cavidad o nicho que debe ocupar en la enzima. Al aplicar esta metodología se logró una conformación mejor ponderada coincidente con 6fcx, para las variantes normal y patológicas analizadas (Figura 4).

Como se observa en la Tabla 1, ninguna de las variantes dio puntuaciones positivas al ensayar la unión de FAD, lo que debe interpretarse como que la conformación resultante es posible pero poco probable para las tres variantes, especialmente para R157Q. La variante normal y A222V tuvieron el mismo valor, levemente negativo y R157Q obtuvo un valor 70% más negativo. R157Q, cuando se presenta junto a A222V dan un cuadro letal. Dado que en los tres casos la conformación coincide con la de 6fcx, se puede interpretar como que la predicción fue correcta pero también informa que esa conformación no es espontánea desde el punto de vista geométrico. Hasta esta instancia los resultados muestran que en la interacción de la enzima con FAD, el sustrato más afín, las variables contribuyentes para la unión son la interacción polar y la no polar, pero para definir la conformación óptima, la que se da naturalmente y que permite la reacción catalizada, hacen falta otros criterios que aún falta definir y ponderar. Buena parte de lo que se afirma sobre esta enzima proviene en realidad del estudio de enzimas menos complejas estructuralmente, presentes en bacterias y hongos. Para corroborar las poses incluyendo en el cálculo la semejanza estructural con proteínas semejantes de otros organismos y para integrar una ponderación de las fuerzas de interacción basada en determinaciones de todas las proteínas semejantes conocidas, se modelaron las variantes con AlphaFold 3 en el servidor y banco de estructuras AlphaFold y los modelos resultantes coincidieron exactamente con las predicciones de DiffDock y con el cristal 6fcx.

En esta instancia ya queda claro que para determinar la posibilidad de que NGN o NRGNN modulen la actividad catalítica de la enzima o puedan ser inhibidores específicos es conveniente evaluar su unión a estructuras de las variantes con FAD unido. Como a la fecha no hay cristales de la enzima humana con FAD y MTHF unidos simultáneamente se ensayó la factibilidad y geometría de la interacción entre MTHF y FAD sin otras moléculas para conocer la geometría óptima de ambas sustancias y lo mismo se hizo para FAD y NRGNN. Las conformaciones más favorables con -4 kcal/mol presentaron los anillos flavínicos de FAD dispuestos en un plano inferior paralelos con los anillos del MTHF (que reciben el electrón en la reacción catalizada por la enzima) en un plano superior, y lo mismo ´para FAD y NRGNN con energías de -3.9 kcal/mol (Fig 6). Estos valores sugieren que MTHF y NRGNN interaccionan espontáneamente con FAD y pueden competir por la interacción si las tres moléculas están juntas.

Con esa información se puede discernir si las conformaciones que se obtengan en los nuevos ensayos de unión de MTHF, NGN y NRGNN a las variantes con FAD incorporado permitirían la transferencia de electrones catalizada por la enzima. Se recurrió al software AC.2.0 en el servidor de SwissDock. Con este recurso se realizan los cálculos considerando a FAD como parte de la estructura receptora e incluso se ponderan sus interacciones con el nuevo ligando, para este caso MTHF, NGN y NRNN. Con estos nuevos modelos se procedió a determinar las energías de interacción de MTHF, NGN y NRGNN en presencia de FAD unido a la enzima. Como se puede observar en la Tabla 1, para la unión de MTHF, la variante normal de la enzima presenta una afinidad levemente inferior a la de A222V y ambas inferiores a R157Q. Pero estas conformaciones con FAD en disposición semejante al cristal son poco probables estructuralmente para las variantes. Pero dado que existe el cristal de la variante normal, se acepta que esa conformación es funcional. En A222V la primera conformación es no funcional, siendo la segunda y tercera las que podrían ser funcionales, pero tienen menor probabilidad que en la variante normal. En el caso de R157Q, la primera conformación es funcional pero el impedimento estructural para que FAD esté ubicado correctamente es 70% mayor que en la variante normal.

En el caso de NRGNN como ligando, las energías son mayores que para MTHF (menor menos negativo el valor menor espontaneidad) y ninguna de las conformaciones se aproxima a la óptima calculada para la interacción FAD-NRGNN en vacío. Pero todas ocupan el espacio central de la cavidad, lo que estorbaría la unión del MTHF. No se reportan resultados de unión de NGN dado que las energías fueron positivas lo que excluye toda posibilidad de unión espontánea.

Conclusiones

Los resultados de la evaluación in silico permiten sugerir que la patogenicidad de las variantes se podría deber a su mayor afinidad por FAD y MTHF, lo que disminuiría la disponibilidad de ligando para la variante normal, pero los complejos formados serían no funcionales debido a que las conformaciones que adoptarían los ligandos unidos están lejos de las que permiten la interacción requerida por la enzima. La disminución de ligando libre y la ineficiencia de las conformaciones en las variantes patológicas determinarían el déficit de función observado en los pacientes.

En cuanto a NGN como inhibidor específico, se descarta porque las energías de unión a la cavidad que une FAD y MTHF fueron positivas. En cambio, su derivado por deglicosilación, NRGNN podría ocupar dicha cavidad en espacios que ocuparía el MTHF. Sin embrago, aunque de esta manera podría inhibir la reducción del MTHF, su afinidad es menos de la mitad de la del MTHF lo que determinaría que su actividad inhibitoria sea dependiente de una alta concentración intracelular.

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Estudio de afinidad de metilentetrahidrofolato reductasa por ligandos naturales y por naringenina como posible inhibidor

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