Tabla 1. Datos demográficos, genéticos y clínicos de los pacientes con candidiasis mucocutánea ...

Figura 1. Producción de IL-17A e IFNγ en pacientes con CMC. CMSP de pacientes con CMC e individuo...

Figura 3. Mutaciones moleculares que acompañan a la CMC. Células productoras de IL-17A e INFγ ten...

Figura 4. Balance en poblaciones linfocitarias Th1 y Th17. Relación entre Li Th1 y Th17 en pacient...

Figura 5. Estudio de correlaciónentre las determinaciones de Citometría de Flujo y ELISA. Correla...

Introducción

La candidiasis mucocutánea crónica (CMC) es un grupo de trastornos genéticamente heterogéneos que se caracteriza por infecciones crónicas o recurrentes que afectan piel, uñas y membranas mucosas, típicamente causada por el género Candida, con C. albicans como el agente etiológico más frecuente1.

C. albicans es un hongo pleomórfico perteneciente a la familia Saccharomyceae. En su morfotipo levaduriforme se comporta como un microorganismo saprófito y convive en simbiosis con su huésped. Forma parte del microbioma habitual de la mucosa del tracto digestivo, vaginal y respiratorio sin causar enfermedad2. Cambios en el microambiente local y desequilibrios en los mecanismos de control, le permiten al hongo desplegar sus atributos de virulencia e iniciar los cambios morfológicos. La emisión de pseudomicelio y expresión de adhesinas facilitan la adherencia y penetración tisular, y la transición al morfotipo hifal contribuye a la invasión tisular y transformación en microorganismo patogénico3,4. Este hongo puede provocar infecciones profundas5 o superficiales presentando diferentes manifestaciones de acuerdo a su localización3. En este último tipo, las formas clínicas de presentación de la enfermedad incluyen candidiasis oral u orofaríngea (OPC) también conocida como muguet, la cual también puede diseminarse hacia esófago, candidiasis intestinal, infección vaginal6,7 y candidiasis cutáneas, pudiendo manifestarse como intertrigos candidiásicos u onicomicosis2,8.

En la respuesta inmune antifúngica, las células T CD4 + helper 17 (Th17), desempeñan un rol relevante4,8. Esta población celular deriva de precursores CD4+ naive o vírgenes a través de la señalización de varias citoquinas inductivas incluyendo interleucinas (IL) como IL-6, IL-1β, TGF-β e IL-239, mientras que la IL-23 también es requerida para la expansión, mantenimiento y función efectora de este linaje10. Los factores de transcripción RORγt (retinoic acid receptor-related orphan receptorgamma) y STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) están implicados en la diferenciación y la función de las células Th17. Esta población celular produce IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22 y GM-CSF, siendo la IL-17A la citoquina referente de este perfil4. La IL-17 activa la señalización a través del receptor de IL-17, que induce la secreción de citoquinas proinflamatorias y péptidos antimicrobianos relevantes para la actividad antifúngica local11. La importancia de IL-17 en la inmunidad antifúngica protectora se evidenció en modelos animales en ratones y en humanos, donde varios defectos genéticos relacionados con la vía de señalización de IL-17 están asociados a una mayor susceptibilidad a adquirir CMC12. Recientemente se demostró que las células T de memoria humana específicas de Candida son predominantemente células Th1713.

Las células Th1 también son importantes en la defensa antifúngica ya que mediante la liberación de citoquinas activan macrófagos y otros fagocitos potenciando los mecanismos candidicidas14. Estas células producen principalmente interferón gamma (IFNγ), citoquina considerada como marcadora de su perfil, e IL-2. Por otra parte, se ha sugerido que la señalización de IFNγ dependiente de STAT1 participa en la regulación negativa de las respuestas Th1715,16. De este modo, el balance Th1 vs. Th17 puede ser utilizado como predictor de un determinado perfil de respuesta en patologías que involucran su función17.

Si bien la CMC es común en pacientes con inmunodeficiencias marcadas de células T, la mayor susceptibilidad a las infecciones por Candida spp. se debe a defectos inmunitarios en el reconocimiento del hongo y en las respuestas mediadas por células Th17 con diferentes mutaciones genéticas de fondo4,8,10. La forma aislada del trastorno, que algunos autores denominan como chronic mucocutaneous candidiasis disease (CMCD) se presenta principalmente, o solamente, con candidiasis mucocutánea. Por el contrario, la forma sindrómica del trastorno se caracteriza por presentar infecciones no invasivas por Candida acompañado de infecciones recurrentes causadas por otros microorganismos18,19.

Polimorfismos genéticos que conducen a defectos en el reconocimiento de Candida (CARD9, DECTIN-1), diferenciación y proliferación Th17 (STAT3, STAT1, TYK2, IL-12B, IL-12RB1) o señalización posterior a través de los receptores de IL17 (IL-17RA, IL-17RC, ACT1, IL-17F) aumentan la susceptibilidad a la CMC y proporcionan evidencia de la importancia del perfil Th17 en la inmunidad antifúngica18,20.

El síndrome de hiper-IgE (HIES) es causado por mutaciones dominantes negativas en los dominios de unión a ADN o SH2 de STAT3 las cuales conducen a una deficiencia significativa en los Th17, presentando los pacientes, una mayor susceptibilidad a padecer CMC21. Las mutaciones con ganancia de función en el gen STAT1 (STAT1-GOF) son la etiología genética más común para CMC. Estas mutaciones conducen a respuestas defectuosas en las células Th1 y Th17. Se ha postulado que el desarrollo deficiente de las células productoras de IL-17 se debe al rol regulador negativo de IFNγ vía STAT1 en esta población celular15,16.

En el presente trabajo se estudió el fenotipo inmune de 9 pacientes pediátricos con CMC de diferente etiología, concurrentes al Hospital Dr. Humberto Notti, de la ciudad de Mendoza, Argentina. Con el objetivo de contribuir al diagnóstico y seguimiento de estos pacientes, se evaluó la frecuencia de Li Th17, Th1, su asociación con las manifestaciones clínicas de la enfermedad, recurrencia de los síntomas y mutaciones identificadas en los pacientes. Se evaluó también la correlación entre los resultados obtenidos para una misma determinación por diferentes metodologías. La importancia de nuestro trabajo radica, por otro lado, en haber podido satisfacer la necesidad de implementar en la provincia una técnica de identificación de defectos del perfil Th17 como herramienta que colabore con el diagnóstico de CMC, para un abordaje temprano de la enfermedad.

Materiales y métodos

Diseño del estudio

Se realizó un estudio observacional, transversal, analítico y prospectivo en 9 pacientes con CMC y 22 individuos controles concurrentes al hospital pediátrico Dr. Humbeto Notti de la ciudad de Mendoza reclutados en el período de febrero a mayo del año 2022.

Se incluyeron pacientes en el rango etario comprendido entre 1 a 17 años de edad, de sexo femenino y masculino, diagnosticados con CMC por el servicio de Inmunología del hospital Dr. Humbeto Notti. Se excluyeron del estudio a los mayores de 17 años, individuos con inmunodeficiencias adquiridas, endocrinopatías o enfermedades autoinmunes y con diagnóstico negativo para CMC. Como grupo control se utilizaron muestras de individuos apareados en edad y sexo, sin signos clínicos de infección aguda ni antecedentes de enfermedades crónicas.

Todos los pacientes brindaron su aprobación para participar del estudio. Se firmaron formularios de consentimiento y/o asentimiento informado de acuerdo a la edad de cada individuo. El diseño del estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación en Salud del Hospital Dr. Humberto Notti. Acta Nº 15/2022.

Toma de muestra

De los pacientes con CMC y los individuos controles se extrajo por venopunción entre 7 a 10 ml de sangre entera, la cual se dividió en dos alícuotas. Una fue anticoagulada con EDTA y utilizada para la recuperación de células mononucleares para estudios de citometría de flujo y la otra, para obtención de suero. Las muestras conteniendo células se procesaron de manera inmediata, mientras que el suero se alicuotó y conservó a –80ºC hasta la determinación de citoquinas por el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

Métodos

Aislamiento de células mononucleares

de sangre periférica

A partir de la muestra de sangre total anticoagulada se procedió a la purificación de las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) mediante separación por gradiente de densidad utilizando Ficoll Hypaque 1.077 g/cm3 (Sigma Aldrich, Darmstadt, Alemania). Una vez aislada la interfase de células mononucleares, se realizaron dos lavados con phosphate buffered saline (PBS) y se ajustó la concentración a 1 x 106 células/ml en medio RPMI 1640 (Cat#11875093, Gibco Laboratories, New York, USA) mediante recuento en cámara de Neubauer.

Cultivo y estimulación antigénica in vitro

Para este estudio se utilizó PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) más Ionomicina (calcium ionophore). El PMA en combinación con la ionomicina son agentes activadores farmacológicos de células T y son utilizados para inducir la producción de citoquinas. Las citoquinas pueden ser posteriormente evaluadas en el sobrenadante del cultivo o acumuladas en el citoplasma celular empleando un bloqueante del transporte intracelular (stop Golgi) para impedir su secreción, lo cual permite la posterior identificación de células productoras de una determinada citoquina.

A tal fin se fraccionó la suspensión de CMSP en alícuotas de 1 ml cada una para ser utilizada en tres condiciones de cultivo diferente:

- Cultivo 1: control de respuesta basal y muerte celular. CMSP cultivadas en RPMI 1064 suplementado con 10% de suero bovino fetal (SBF) (Sigma-Aldrich), en ausencia de estímulo e incubadas durante 5 hs.

- Cultivo 2: CMSP cultivadas en RPMI 1064-10% SBF, en presencia de PMA (Cat#P1585,Sigma-Aldrich) más Ionomicina (Cat#I0634,Sigma-Aldrich) en una concentración de 50 ng/ml y 1 µg/ml, respectivamente, durante 5 hs. Tres horas antes de cosechar las células se adicionó 0,7 µl de stop Golgi (Cat#554724 Becton Dickinson, Nueva Jersey, USA).

- Cultivo 3: CMSP cultivadas en RPMI 1064-10% SBF, en presencia de PMA más Ionomicina en una concentración de 50 ng/ml y 1 µg/ml respectivamente, durante 5 hs. El sobrenadante de cultivo se recuperó para la posterior determinación de citoquinas por ELISA.

Todos los cultivos se realizaron en condiciones de esterilidad y se incubaron a 37ºC en atmósfera de CO2 al 5%22.

Citometría de flujo

Inmunomarcación con anticuerpos monoclonales

Luego del cultivo y previo a la marcación con anticuerpos monoclonales, las células se lavaron dos veces con 1 ml de stain buffer (Cat#554656, Becton Dickinson) cada vez. Se realizó la inmunomarcación utilizando un Kit comercial: Human Th1/Th17 Phenotyping kit (Cat#560752, Becton Dickinson) conteniendo un cóctel de anticuerpos monoclonales (CD4 PerCP-Cy5.5 clon: SK3, IFN-γ FITC clon: B27, IL-17A PE clon: N49-653) Las células se fijaron con buffer de fijación (Cat#554655, Becton Dickinson), posteriormente se permeabilizaron (Cat#554723, Becton Dickinson) y finalmente se realizó la marcación con anticuerpos monoclonales de acuerdo a las recomendaciones del fabricante para este Kit. Se utilizaron controles de isotipo para confirmar la especificidad de unión del anticuerpo y descartar interacciones inespecíficas23.

Adquisición y evaluación de las muestras

Las muestras se adquirieron con un citómetro de flujo FACs CANTO II (Becton Dickinson), considerando un mínimo de 20.000 eventos CD4+. El porcentaje de células positivas para IL-17A e IFN-γ se midió dentro de la población CD4+. Los datos se analizaron con el programa FACsDiva (BD FACS Diva v9.0 Software).

Estrategia de selección de la población celular (Gate)

En primer lugar se realizó un gate morfológico para linfocitos (Li), en donde la población celular de interés se seleccionó por tamaño y complejidad interna (P1) Forward versus Side Scatter (FSC vs SSC). Posteriormente, a partir de P1, se seleccionaron aquellas células que expresan CD4+ en su superficie (P2) (Figura 1). Sobre esta población de linfocitos CD4+ (100%), se determinó el porcentaje de células que expresaron IL-17A intra-citoplasmáticamente, quedando así definido la población celular Th17 (CD4+IL-17A+); el mismo procedimiento se realizó para evaluar el porcentaje de células con expresión citoplasmática de IFNγ, definiendo así el perfil Th1 (CD4+IFNγ+).

ELISA de captura

Con el fin de evaluar la producción de interleuquinas a través de una segunda técnica, el suero de los pacientes y el sobrenadante de cultivo de PBMC, se utilizaron para medir las concentraciones de IL-17A (Human IL-17A ELISA, Cat#DY317, RD Systems) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Las concentraciones de proteínas se cuantificaron por extrapolación de la curva estándar24.

Análisis estadístico

Los resultados se analizaron mediante la prueba de la t de Student para datos apareados con el propósito de comparar pacientes con CMC y control sano. Los resultados se expresaron como medias ± SEM y el nivel de significación se estableció en un valor de p ≤ 0,05. ANOVA con post test de Bonferroni para poder comparar entre 3 grupos de pacientes. Correlación de Pearson entre dos variables para una misma muestra. Los datos se analizaron con el software GraphPad PRISM 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)

Resultados

Características de los pacientes

con CMC participantes del estudio

La CMC corresponde a un grupo heterogéneo de patologías asociado a desórdenes monogénicos o mutaciones puntuales, que comprometen la defensa antifúngica. Los estudios inmunológicos permiten aportar evidencia sobre el fenotipo de los pacientes con CMC y la severidad de la disfunción23. Con el objetivo de contribuir al diagnóstico y seguimiento de estos pacientes en la provincia de Mendoza, se procedió a la implementación de la técnica diagnóstica por citometría de flujo, estudiando la población de linfocitos Th17 en una cohorte de 9 pacientes con CMC concurrentes al Hospital Dr. Humberto Notti de Mendoza (Tabla 1). El rango etario de los pacientes fue entre 1 y 17 años, 6 de ellos de sexo masculino y 3 femenino. Respecto al diagnóstico y genotipo de los pacientes, 4 de ellos presentaron sintomatología clínica característica y se diagnosticaron como CMC, 2 de ellos hermanos; otros 3 individuos presentaron CMC con una mutación en STAT1-GOF, 2 de ellos hermanos; y los 2 pacientes restantes con HIGES con mutación en STAT3. Se constató la localización de las lesiones a nivel de los tractos mucosos y/o cutáneos, como así también la recurrencia de los síntomas en el transcurso de un año, los años de evolución desde el diagnóstico de la enfermedad, y el tratamiento indicado en cada caso. Además, se incluyeron 22 muestras de pacientes controles sanos apareados en edad y sexo.

Los pacientes con CMC presentan

una alteración en la diferenciación

de los linfocitos hacia el perfil Th17

Las células Th17 desempeñan un rol clave en la respuesta inmune antifúngica, participando en la inmunidad protectora a nivel de las barreras mucosas y cutáneas25. Su efecto biológico es mediado por la liberación de citoquinas, principalmente por la IL-1726. La capacidad funcional de esta población celular puede ser determinada ex vivo luego de la estimulación de las CMSP con un mitógeno, y anticuerpos monoclonales dirigidos contra moléculas o marcadores expresados en la superficie celular, o en citoplasma. En este trabajo evaluamos la producción intracelular de citoquinas en la subpoblación de Li T CD4+ de pacientes con CMC e individuos controles, mediante la estimulación in vitro de CMSP con PMA/ionomicina y posterior identificación por citometría de flujo de (Figura 1). Basados en la morfología celular (FSC vs SSC) y en la expresión del marcador de superficie CD4, definimos la población de estudio, sobre la cual se determinó la producción de citoquinas intracelulares (Figura 1A). La técnica de CF permite la identificación simultánea de diferentes perfiles inmunológicos dependiendo de las proteínas que expresen. De esta manera, en una misma muestra, puede establecerse el perfil Th1 y Th17 determinado por la expresión intracelular de IFNγ e IL-17A, respectivamente.

Se evaluó la frecuencia de Li T CD4+ productoras de IL-17A e IFNγ en pacientes con CMC e individuos controles sanos. La Figura 1B muestra dot plots representativos de cada grupo evaluado. Se observó, que el porcentaje de células productoras de IL-17A, se redujo significativamente en los pacientes con CMC en comparación con los individuos controles (Figura 1C), evidenciando una disminución de la población de los Li Th17 en los individuos con la patología. Cuando el perfil Th1 fue evaluado, observamos que el porcentaje de células productoras de IFNγ aumentó significativamente en los pacientes con CMC en comparación con controles sanos (Figura 1D).

El estudio del porcentaje de linfocitos CD4+ IL-17A+ en 20 individuos controles sanos incluidos en esta cohorte, nos permitió establecer el valor muestral de media ± SEM igual a 0,89%±0,37% para los Li T CD4+ IL-17A+, con un rango de variación entre 0,52% a 1,26%. Los resultados obtenidos para la población Th17 en los pacientes con CMC mostraron que un 66.6% de los individuos afectados poseen valores por debajo o en el límite inferior del rango establecido.

También se determinó el porcentaje de Li T CD4+ IFNγ+ en 22 individuos controles, estableciéndose el valor de la media ± SEM de 7,07%±4,04%, con un rango de variación que osciló entre 3,03% y 11,11%. Se observó que solo el 44,4% de los pacientes con CMC presentan valores por encima de este intervalo.

La frecuencia de Li Th17 en los pacientes con CMC no guarda relación con

los sitios comprometidos, ni con

la recurrencia de los síntomas

Con el propósito de establecer si la disminución de la frecuencia de células productoras de IL-17A guarda alguna relación con las diferentes localizaciones de la infección por Candida, se agruparon a los pacientes en dos categorías; Aquellos pacientes con presentación clínica únicamente a nivel mucoso, como muguet o candidiasis vaginal, o aquellos con la presentación de la enfermedad asociada con afectación a nivel cutáneo (Figura 2A). Debido a que también se observaron cambios en la frecuencia de células productoras de IFNγ en estos pacientes, se analizó la existencia de alguna asociación según las lesiones fueran mucosas o mucocutáneas. La Figura 2B muestra la distribución individual en cada paciente con CMC según el sitio comprometido con la infección y la frecuencia de Li Th1; no se observaron diferencias significativas cuando ambos grupos se compararon. Los valores promedios de cada grupo de pacientes, se compararon con los valores de referencia establecidos para individuos controles sanos para ambas poblaciones celulares en estudio; no se observaron diferencias significativas entre los grupos cuando la frecuencia de células productoras de IL-17A fue comparada (Figura 2C). Al realizar este análisis sobre la frecuencia de células productoras de IFNγ, tampoco se encontraron diferencias significativas (Figura 2D).

Las infecciones superficiales causadas por C. albicans en pacientes con CMC se caracterizan por presentarse de manera recurrente o persistente a lo largo del tiempo1. Con el objetivo de establecer si existe asociación entre la periodicidad de los síntomas y el porcentaje de células Th17, se estableció la frecuencia promedio anual de la recurrencia de síntomas de la cohorte en estudio y, en base a eso, los pacientes se clasificaron según presentaran una frecuencia menor o mayor 7 episodios de candidiasis en el transcurso de un año. No se observaron diferencias significativas para este parámetro (Figura 2E). Resultados similares se hallaron cuando la frecuencia de células Th1 y la recurrencia de los síntomas fue analizada (Figura 2F).

La frecuencia de Li Th17 es independiente de la mutación molecular que presente el paciente

La incidencia real de la enfermedad de CMC se desconoce, y se carece de datos nacionales de referencia. En tal sentido, el grupo de pacientes incluidos en este trabajo representa una muestra sumamente valiosa para el análisis de diferentes parámetros clínicos de la enfermedad y su relación con el fenotipo inmune de cada paciente. Aunque el número de pacientes en nuestra cohorte fue de 9 individuos, y en virtud de la escasez de publicaciones nacionales que pueden ser consultadas, es que se procedió a estudiar la existencia de algún perfil particular en el grupo de pacientes. Evaluamos la frecuencia de células productoras de IL-17A, teniendo en cuenta el diagnóstico referido que acompaña a la presentación clínica de CMC como principal síntoma, ya sea se trate de un síndrome de hiper-IgE con mutación en STAT3, pacientes con mutación STAT1-GOF, o pacientes que no tienen una mutación genética confirmada al momento de realizar este estudio. Los resultados obtenidos para cada grupo se compararon entre sí, y con el grupo de individuos controles. No encontramos diferencias significativas entre los grupos de pacientes estudiados (Figura 3A). Al realizar este mismo análisis sobre la frecuencia de células productoras de IFNγ, observamos un aumento significativo en los pacientes que presentan CMC asociada a HIGES respecto a los individuos controles (Figura 3B), sin observar diferencias estadísticas para el resto de los grupos analizados.

Existe un marcado aumento en la

relación Th1/Th17 en pacientes con CMC

La variación en el balance entre linfocitos de diferente perfil funcional puede ser indicador de defectos en los mecanismos de respuesta inmune en distintas patologías27,28. Con este propósito, establecimos el cociente entre los porcentajes de células con perfil Th1, en relación a las células con perfil Th17 (ratio Th1/Th17) en pacientes con CMC. Observamos, que este parámetro fue estadísticamente diferente con respecto al valor obtenido para el grupo control, siendo significativamente mayor (3,57 veces) en los pacientes con la patología (Figura 4A). En el panel B de la figura 4, se muestra la correlación entre el porcentaje de células productoras de IFNγ vs. el porcentaje de células productoras de IL-17A, para una misma muestra. No observamos correlación estadísticamente significativa entre el porcentaje de ambas poblaciones celulares en estudio en el grupo de pacientes con CMC, como así tampoco en los individuos sanos (Figura 4B).

La frecuencia de células productoras de IL-17A, no mostró correlación con la secreción de IL-17A

El estudio de las poblaciones inmunes productoras de una determinada citoquina por la técnica de citometría de flujo requiere una infraestructura compleja y por ello no es una metodología disponible en todos los laboratorios de análisis clínicos; en tanto, las técnicas que permiten evaluar la concentración de una citoquina en sobrenadante de cultivo o suero son más accesibles. Con el fin de comparar dos metodologías que permitan evaluar el perfil de respuesta Th17 en los pacientes con CMC, se determinó para un mismo individuo la expresión de células productoras de IL-17A en CMSP por citometría de flujo (%CD4+ IL-17A+) y se correlacionó con la concentración de IL-17A (pg/ml) en sobrenadante de cultivo utilizando la técnica de ELISA (Figura 5). El análisis efectuado permitió establecer que no existe correlación en los resultados obtenidos por ambas técnicas para un mismo paciente con CMC.

Finalmente, y con el mismo propósito antes mencionado, se consideró implementar la determinación de la concentración sérica de IL-17A (pg/ml) utilizando la técnica de ELISA. Se procedió a realizar la determinación en una muestra representativa de individuos de nuestra cohorte (n=6) y en individuos controles (n=6), la concentración de esta citoquina resultó no detectable por la metodología utilizada. Estos resultados están en concordancia con lo reportado para pacientes con otras formas de infección por este hongo7.

Discusión

La CMC es una enfermedad que afecta a la población pediátrica, con una mayor incidencia en la primera infancia. Generalmente se manifiesta asociada a fallas o disfunciones inmunes congénitas en los mecanismos de respuesta antifúngicos1,18,19. En nuestro país, no existen datos de la incidencia de esta patología, hecho posiblemente asociado a la falta de registros públicos y a la complejidad de realizar un diagnóstico inmunológico y genético que permita su correcta identificación. Por otro lado, Argentina cuenta con escasos laboratorios con posibilidades de realizar este tipo de estudios, lo cual determina la gran relevancia del desarrollo y puesta a punto de metodologías sensibles, como herramientas que colaboren con el diagnóstico de CMC, para un abordaje temprano de la enfermedad.

Este trabajo se centró en el estudio de la población de Li Th17 en 9 pacientes pediátricos con CMC de diferente etiología, concurrentes al Hospital Dr. Humberto Notti, de Mendoza. El objetivo fue contribuir al diagnóstico, orientar sobre la severidad de la enfermedad y el seguimiento de su evolución. En esta cohorte, se evaluó la frecuencia de las poblaciones de linfocitos Th17 y Th1 de en sangre periférica, el balance entre las mismas expresado como la relación Th17/Th1 y la existencia de posibles asociaciones con características clínicas de la CMC. Se incluyeron también 22 individuos controles. Las poblaciones celulares se evaluaron por citometría de flujo, y la concentración de IL-17A por la técnica de ELISA.

Nuestros resultados mostraron que la frecuencia de células Th17 estuvo significativamente disminuida en pacientes con CMC, en comparación con los individuos controles. De esta manera, se aporta al diagnóstico clínico evidencia sobre la característica de la disfunción inmune presente en estos pacientes. Estos resultados están de acuerdo con lo reportado por otros autores29,30 y reafirman que las fallas o defectos en la población Th17 contribuyen a la falta y/o alteración de respuesta inmune frente a la infección por Candida ssp.31. Los mecanismos por los cuales ocurre esta disminución aún no se comprenden por completo y continúan siendo tema de estudio. Trabajos en modelos animales de infecciones mucosas por Candida en ratones normales, o con deleciones en algunos elementos que conducen a la diferenciación y a las vías intracelulares dependiente de IL-17, aportan evidencia en este sentido32,33. En pacientes con la enfermedad y mutaciones puntuales identificadas, la característica de la disfunción fue establecida34,35. En nuestro estudio, el 66,6% de los pacientes presentó valores de linfocitos Th17 por debajo del rango determinado en los individuos controles. En este sentido, la determinación de este parámetro inmunológico podrían ser de utilidad como marcador de enfermedad, contribuyendo así con el diagnóstico de CMC. Actualmente, en nuestro país la identificación este tipo de deficiencias solo se realiza en el Hospital de Pediatría Prof. Dr. Juan P. Garrahan, por lo tanto, la implementación de esta metodología diagnóstica en un hospital de referencia en la región de Cuyo constituye un aporte significativo para la precoz identificación de estos pacientes y su temprano tratamiento.

La frecuencia de células productoras de IFNγ, hallada en los pacientes de esta cohorte, fue superior en el grupo de individuos con CMC en comparación con los controles, evidenciando un predominio del perfil Th1 en detrimento del perfil Th17. Cerboni y cols.17 sostienen que este fenómeno ocurre como un mecanismo compensatorio de respuesta frente a la disfunción, y que está determinado por la plasticidad de las células T helper en búsqueda de desarrollar una respuesta inmune efectiva frente a la infección por Candida ssp. De esta manera, se desencadena una respuesta inmune protectora de tipo Th1, aunque finalmente resulta insuficiente para contrarrestar la infección. Por otra parte, Park y cols.36 también señalan que, debido a la falta de una respuesta antifúngica eficiente y al hecho de que el mecanismo de retroalimentación negativa que regula la expansión de las células Th1 con el fin de mantener la homeostasis, también se ve alterado, la respuesta Th1 se encuentra potenciada. Sin embargo, nuestros resultados muestran que solo un 44,4% de los pacientes con CMC presentaron valores por encima del rango de referencia de nuestra cohorte para células productoras de IFNγ.

Los efectos biológicos de los Li Th17 son mediados por citoquinas liberadas por estas células, y dentro de ellas la IL-17A desempeña un rol relevante11,12. En este trabajo evaluamos su concentración en sobrenadante de cultivo. No encontramos correlación entre los resultados obtenidos para IL-17A (ELISA) y la población de Li productores de IL-17A determinados por citometría de flujo. Aunque la técnica de ELISA es una metodología más económica y asequible a varios laboratorios clínicos, cuenta con un nivel de sensibilidad que resulta insuficiente para la medición de este tipo de citoquinas. Aquí reportamos valores detectables solo para algunas muestras de sobrenadante de cultivo, e incluso su concentración resultó indetectable en todas las muestras de suero analizadas7. Estas observaciones denotan la importancia de la realización de los cultivos celular primarios y la estimulación linfocitaria in vitro para aumentar la sensibilidad de la medición22, resaltando la importancia del estudio funcional de la población Th17, utilizando citometría de flujo, como tecnología de vanguardia para el estudio de este tipo de patologías.

La CMC puede presentar diferente etiología. Pacientes con HIES y mutación en STAT1-GOF desarrollan CMC como un fenotipo infeccioso importante que es categorizado como CMC sindrómico. Por el contrario, en la CMCD, las manifestaciones mucocutáneas características del fenotipo se dan en ausencia de otros signos clínicos prominentes, y asociado también con defectos genéticos que tiene un impacto directo en la señalización de IL-1718. La incidencia real de la enfermedad se desconoce, sin embargo, las cifras para HIES en Argentina es de 1 en 1.000.000 recién nacidos vivos, con una relación de prevalencia de hombres respecto de las mujeres de 2:137. No obstante, y a pesar de que el número de pacientes que pudieron ser reclutados fueron 9, la cohorte en estudio representa el espectro de estas tres formas de CMC. En ella, se observó que la prevalencia de la enfermedad respecto al sexo fue 2:1, hombre respecto de mujeres y en el caso particular de CMC-HIES, los dos pacientes fueron varones. Nuestro estudio arrojó resultados que concuerdan con lo publicado por otros autores29,30, encontrando disminución de la frecuencia de células Th17, aunque esta disminución fue independiente de si el paciente presentó una mutación molecular o fuera clasificado como CMC. El vínculo común entre todos estos trastornos es una deficiencia en la función efectora de la población Th17. Mientras que en la CMC aislada el pronóstico es bueno, la morbilidad está relacionada con la cronicidad y persistencia de las infecciones por Candida en piel, uñas y membranas mucosas; por lo que comprender mejor la biología Th17 con el fin de modular su función, mediante la implementación de diferentes tratamientos, podría ser de gran utilidad para disminuir sus consecuencias38.

Nosotros observamos que la disminución en la frecuencia de linfocitos Th17 en los pacientes con CMC no guarda relación con los sitios comprometidos ni con la recurrencia de los síntomas. No obstante, observamos una tendencia de disminución más marcada en la frecuencia de células productoras de IL-17A en pacientes con HIES con respecto a los controles, y de manera similar pero no tan pronunciada en los pacientes con la mutación de STAT1-GOF. Solo se detectaron diferencias estadísticamente significativas respecto a los individuos controles para el aumento de las células Th1 en pacientes con HIES. Posiblemente, la inclusión de un mayor número de casos permitirá establecer de manera más certera el fenotipo inmune asociado a cada presentación de la CMC.

Respecto al balance entre las poblaciones Th1/Th17, los resultados indicaron que existe un claro desequilibrio entre los perfiles de células Th1 respecto de las Th17 células18,27,28. El desequilibrio entre estas poblaciones podría ser un marcador importante para el diagnóstico, y para predecir el grado de la disfunción inmune del paciente, constituyendo también un parámetro a tener en cuenta durante el monitoreo del tratamiento39,40. Aunque no observamos la existencia de correlación entre ambos perfiles celulares en un mismo individuo, indicando que no existe un aumento proporcional de células productoras de IFNγ que resulte en detrimento de la disminución de la población Th17, se pudo observar una clara tendencia de agrupación de los pacientes con CMC en los niveles más bajos para el porcentaje de linfocitos Th17, independientemente del valor individual de frecuencia de Li Th1 que presente. Para los individuos controles, observamos valores más bajos de frecuencia de células productoras de IFNγ, acompañados de valores variables de IL-17A.

La técnica de CF proporciona un método rápido, aunque complejo, para identificar deficiencias en las células productoras de IL-17, lo cual podría usarse como guía para el diagnóstico de mutaciones genéticas específicas, lo que facilita un enfoque y un tratamiento más personalizado, teniendo en cuenta las nuevas oportunidades terapéuticas, evitando las complicaciones dadas por la cronicidad de la infección por Candida. Sería de gran importancia poder realizar más estudios como el presente en otros centros hospitalarios de nuestro país, que posibilite incluir un mayor número de pacientes con CMC, que permitan extender las observaciones reportadas en este trabajo, no solo con el fin de establecer la incidencia real de la CMC en nuestro medio, sino además para tener un mejor conocimiento de las inmunidad anti Candida mediada por la IL-17.

Agradecimiento

Agradecemos al Laboratorio de Citometría de Flujo dependiente del Programa Provincial de SIDA e Inmunodeficiencias (PAPSI) por el apoyo económico, y a los miembros de este laboratorio por la colaboración permanente. Y a los miembros del Servicio de Inmunología del Hospital Pediátrico Dr. H. Notti.

1. Green L, Dolen WK. Chronic Candidiasis in Children. Curr Allergy Asthma Rep. 2017 May;17(5):31. doi: 10.1007/s11882-017-0699-9.

2. Lopes JP, Lionakis MS. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 2022 Dec;13(1):89-121. doi: 10.1080/21505594.2021.2019950.

3. Sotomayor CE, Miró MS, Masih DT. Cap. 28 Respuesta inmune a infecciones fúngicas. En: Microbiología Biomédica, editores: Basualdo, Coto, De Torres. 2º ed. CABA. Ed.Atlante. 2018.

4. Miró, MS; Vigezzi, C; et al. Receptores Innatos e Il-17 en la respuesta inmune frente a hongos patógenos humanos. Revista de la Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Córdoba. 2016; 73(3):188-96.

5. Riera FO, Caeiro JP, Angiolini SC, et al. Invasive Candidiasis: Update and Current Challenges in the Management of This Mycosis in South America. Antibiotics (Basel). 2022 Jun 30;11(7):877. doi: 10.3390/antibiotics11070877.

6. Miró MS, Rodriguez E, Icely PA, et al.. Recurrent vulvovaginal candidiasis: an old disease with new challenges. Revista Iberoamericana de Micología. 2017;33(4):1130-406.

7. Miró MS, Caeiro JP , Rodriguez E, et al. Candida albicans Modulates Murine and Human Beta Defensin-1 during Vaginitis. J. Fungi 2022, 8(1), 20; https://doi.org/10.3390/jof8010020

8. Gaffen SL, Moutsopoulos NM. Regulation of host-microbe interactions at oral mucosal barriers by type 17 immunity. Sci Immunol. 2020 Jan 3;5(43):eaau4594. doi: 10.1126/sciimmunol.aau4594.

9. Caza T, Landas S. Functional and Phenotypic Plasticity of CD4(+) T Cell Subsets. Biomed Res Int 2015;2015:521957. doi: 10.1155/2015/521957.

10. Annunziato F, Romagnani S. Do studies in humans better depict Th17 cells? Blood. 2009 Sep 10;114(11):2213-9. doi: 10.1182/blood-2009-03-209189.

11. Song X, Gao H, Qian Y. Th17 differentiation and their pro-inflammation function. Adv Exp Med Biol. 2014;841:99-151. doi: 10.1007/978-94-017-9487-9_5.

12. Mengesha BG, Conti HR. The Role of IL-17 in Protection against Mucosal Candida Infections. J Fungi (Basel). 2017 Sep 27;3(4):52. doi: 10.3390/jof3040052.

13. Acosta-Rodriguez EV, Rivino L, Geginat J et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nat Immunol. 2007 Jun;8(6):639-46. doi: 10.1038/ni1467.

14. Saravia J, Chapman NM, Chi H. Helper T cell differentiation. Cell Mol Immunol. 2019 Jul;16(7):634-643. doi: 10.1038/s41423-019-0220-6.

15. Okada S, Asano T, Moriya K, et al. Human STAT1 Gain-of-Function Heterozygous Mutations: Chronic Mucocutaneous Candidiasis and Type I Interferonopathy. J Clin Immunol. 2020 Nov;40(8):1065-1081. doi: 10.1007/s10875-020-00847

16. van de Veerdonk FL, Plantinga TS, Hoischen A, et al. STAT1 mutations in autosomal dominant chronic mucocutaneous candidiasis. N Engl J Med 2011 Jul 7;365(1):54-61. doi: 10.1056/NEJMoa1100102.

17. Cerboni S, Gehrmann U, Preite S, Mitra S. Cytokine-regulated Th17 plasticity in human health and diseases. Immunology 2021 May;163(1):3-18. doi: 10.1111/imm.13280.

18. Okada S, Puel A, Casanova JL, et al. Chronic mucocutaneous candidiasis disease associated with inborn errors of IL-17 immunity. Clin Transl Immunology. 2016 Dec 2;5(12):e114. doi: 10.1038/cti.2016.71.

19. Puel A, Cypowyj S, Maródi L, Abel L, Picard C, Casanova JL. Inborn errors of human IL-17 immunity underlie chronic mucocutaneous candidiasis. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2012 Dec;12(6):616-22. doi: 10.1097/ACI.0b013e328358cc0b.

20. Glocker EO, Hennigs A, Nabavi M, et al. A homozygous CARD9 mutation in a family with susceptibility to fungal infections. N Engl J Med 2009 Oct 29;361(18):1727-35. doi: 10.1056/NEJMoa0810719. 

21. Conti HR, Baker O, Freeman AF, et al. New mechanism of oral immunity to mucosal candidiasis in hyper-IgE syndrome. Mucosal Immunol 2011 Jul;4(4):448-55. doi: 10.1038/mi.2011.5.

22. Renna MS, Figueredo CM, Rodríguez-Galán MC, et al. Candida albicans up-regulates the Fas-L expression in liver Natural Killer and Natural Killer T cells. Immunobiology 2015 Nov;220(11):1210-8. doi:10.1016/j.imbio.2015.06.014.

23. Freer G, Rindi L. Intracellular cytokine detection by fluorescence-activated flow cytometry: basic principles and recent advances. Methods 2013 May 15;61(1):30-8. doi: 10.1016/j.ymeth.2013.03.035.

24. Babaloo Z, Oskoei MR, Kohansal MH, Barac A, Ahmadpour E. Serum profile of IL-1β and IL-17 cytokines in patients with visceral leishmaniasis. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2020 Apr;69:101431. doi: 10.1016/j.cimid.2020.101431.

25. Honda K, Littman DR. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 2016 Jul 7;535(7610):75-84. doi:10.1038/nature18848.

26. Bacher P, Hohnstein T, Beerbaum E, et al. Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans. Cell. 2019 Mar 7;176(6):1340-55.e15. doi: 10.1016/j.cell.2019.01.041.

27. Nurjadi D, Kain M, Marcinek P, Gaile M, Heeg K, Zanger P. Ratio of T-Helper Type 1 (Th1) to Th17 Cytokines in Whole Blood Is Associated With Human β-Defensin 3 Expression in Skin and Persistent Staphylococcus aureus Nasal Carriage. J Infect Dis. 2016 Dec 1;214(11):1744-1751. doi: 10.1093/infdis/jiw440.

28. Bazzazi H, Aghaei M, Memarian A, Asgarian-Omran H, Behnampour N, Yazdani Y. Th1-Th17 Ratio as a New Insight in Rheumatoid Arthritis Disease. Iran J Allergy Asthma Immunol 2018 Feb;17(1):68-7

29. McDonald DR. TH17 deficiency in human disease. J Allergy Clin Immunol. 2012 Jun;129(6):1429-35; quiz 1436-7. doi: 10.1016/j.jaci.2012.03.034.

30. Eyerich K, Foerster S, Rombold S, Seidl HP, Behrendt H, Hofmann H, Ring J, Traidl-Hoffmann C. Patients with chronic mucocutaneous candidiasis exhibit reduced production of Th17-associated cytokines IL-17 and IL-22. J Invest Dermatol. 2008 Nov;128(11):2640-2645. doi: 10.1038/jid.2008.139. Epub 2008 Jul 10. PMID: 18615114.

31. Xu S, Cao X. Interleukin-17 and its expanding biological functions. Cell Mol Immunol. 2010 May;7(3):164-74. doi: 10.1038/cmi.2010.21.

32. Conti HR, Bruno VM, Childs EE, Daugherty S, Hunter JP, Mengesha BG, et al. IL-17 receptor signaling in oral epithelial cells is critical for protection against oropharyngeal candidiasis. Cell Host Microbe. (2016) 20:606–17. doi: 10.1016/j.chom.2016.10.001

33. Conti HR, Gaffen SL. IL-17-mediated immunity to the opportunistic fungal pathogen Candida albicans. J Immunol (2015) 195:780–8. doi: 10.4049/jimmunol.1500909

34. Puel A, Cypowyj S, Bustamante J, Wright JF, Liu L, Lim HK, et al. Chronic mucocutaneous candidiasis in humans with inborn errors of interleukin-17 immunity. Science (2011) 332:65–8. doi: 10.1126/science.12 00439

35. Shamriz O, Tal Y, Talmon A, Nahum A. Chronic Mucocutaneous Candidiasis in Early Life: Insights Into Immune Mechanisms and Novel Targeted Therapies. Front Immunol 2020 Oct 16;11:593289. doi: 10.3389/fimmu.2020.593289.

36. Park H, Li Z, Yang XO, et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 2005 Nov;6(11):1133-41. doi: 10.1038/ni1261.

37. Orphanet. Noviembre 2022 https://www.orpha.net/consor/cgi-bin/OC_Exp.php?lng=es&Expert=2314

38. Marazzi MG, Bondi E, Giannattasio A, Strozzi M, Savioli C. Intracranial aneurysm associated with chronic mucocutaneous candidiasis. Eur J Pediatr 2008 Apr;167(4):461-3. doi: 10.1007/s00431-007-0490-3.

39. Annunziato F, Cosmi L, Santarlasci V, et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 2007 Aug 6;204(8):1849-61. doi: 10.1084/jem.20070663.

40. Lee YK, Turner H, Maynard CL, et al. Late developmental plasticity in the T helper 17 lineage. Immunity. 2009 Jan 16;30(1):92-107. doi: 10.1016/j.immuni.2008.11.005.

Para descargar el PDF del artículo
Estudio del perfil Th17 en pacientes pediátricos con candidiasis mucocutánea crónica de la provincia de Mendoza

Haga click aquí