Figura 1. Proceso de elaboración de GAMMASUB UNC. Sob: sobrenadante.

Tabla 1. Caracterización bioquímica y funcional.

Figura 2. Resultados de FXIa en GAMMASUB y comercial (ng/ml).

Tabla 2. Factores de la coagulación expresados en UI/ml.

Figura 3. Prueba global de trombogenicidad empleando el NAPTT.

Introducción

Los concentrados de inmunoglobulinas (Igs) derivados del plasma humano han sido empleados desde hace más de cinco décadas como terapia de reemplazo en pacientes que padecen inmunodeficiencias (ID)1. Inicialmente, la vía intramuscular (im) fue la más utilizada, pero debido a los efectos adversos que producía, surgieron nuevas formulaciones que permitieron disponer de concentrados de Igs para ser administrados por la vía intravenosa (iv)2. La implementación de esta vía dio origen a nuevas aplicaciones terapéuticas y efectivas como en las ID severas, en enfermedades hematológicas e inflamatorias, en desórdenes neuromusculares, en enfermedades autoinmunes e infecciosas, y en otras que requieren dosis elevadas de Igs provocando menor cantidad de efectos adversos que los detectados con la vía im3.

A partir de los años ’90, se consideró la vía subcutánea (sc) como una alternativa válida de administración para el tratamiento de las ID y desde entonces su uso se ha ido incrementado debido a las ventajas que posee con respecto a las otras vías de administración4,5. A través de estudios clínicos, tanto en niños como en adultos, se detectó una menor incidencia de efectos adversos sistémicos, se demostró su eficacia y seguridad6, y al evitar el acceso venoso, se hizo posible la administración domiciliaria, evitando la presencia de personal especializado y la permanencia en centros asistenciales7. Es importante destacar que se detectaron concentraciones de IgG en sangre más estables y persistentes en el tiempo que las obtenidas con la infusión iv; y generalmente, los efectos adversos estuvieron relacionados con el sitio de inyección8.

El Laboratorio de Hemoderivados de la Universidad Nacional de Córdoba (H-UNC) desarrolló GAMMASUB UNC, un concentrado de IgG de administración sc, teniendo en cuenta la demanda nacional de este medicamento y considerando la amplia experiencia en la elaboración de concentrados de Igs, eficaces y seguros, tanto para administración im como iv9.

El método de elaboración empleado para la producción de estos medicamentos está basado en el fraccionamiento alcohólico en frío de Cohn-Oncley (Figura 1)10,11 a partir de una mezcla de plasma humano y la IgG purificada a partir de ella, y cumple con los parámetros de calidad requeridos a nivel nacional e internacional y con las Buenas Prácticas de Fabricación y Control (BPFyC)12,13.

El presente estudio tiene por objetivo analizar las características fisicoquímicas, biológicas y de seguridad viral mediante técnicas in vitro en los concentrados de GAMMASUB UNC y compararlas con las de un producto comercial con características de calidad similares14.

Materiales y método

Método de elaboración

GAMMASUB UNC fue elaborado a partir de plasma de donantes voluntarios, que se controla individualmente en los Bancos de Sangre de origen para marcadores serológicos virales y re-analizados en el H-UNC. La mezcla de plasma, proveniente de más de 1000 donantes sanos15, es procesada por precipitación alcohólica y se incluye como método de inactivación viral específico el calentamiento a 60ºC durante 10 hs (pasteurización). El producto final es formulado a una concentración proteica de 160 g por litro y previo a su envasado aséptico es filtrado con membranas esterilizantes.

Muestras

Se evaluaron tres lotes de GAMMASUB UNC al 16% en sus tres presentaciones (3, 10 y 20 ml) y dos lotes de un producto comercial formulado al 16% en una única presentación.

Métodos de control

Las formulaciones se controlaron con los métodos analíticos requeridos en las monografías de Farmacopea Europea 8va Edición (FE)16-18 y además, para completar la caracterización, se emplearon técnicas descriptas en otras farmacopeas19,20, pero no exigidas para la liberación del producto.

Caracterización bioquímica y funcional

El aspecto de la solución proteica de las preparaciones de Igs fue evaluado mediante inspección visual y la determinación del pH se realizó de acuerdo al método 2.2.3 de FE. Mediante el método de Gornall, 2.5.9 de FE, se determinó la concentración de proteínas, empleando como material de referencia una solución de albúmina sérica humana valorada frente al Bovine Serum Albumin (Standard Reference Material 927d) (NIST).

La distribución molecular (monómeros, dímeros, polímeros y fragmentos de IgG) fue analizada por cromatografía de exclusión (HPLC) según el método 2.2.29 de FE y la composición proteica se analizó por electroforesis zonal en acetato de celulosa, acorde al método 2.2.31 de FE, frente al estándar, Human Immunoglobulin for Electrophoresis BRP batch 2 (EDQM), que contiene entre 75,7% y 80,9% del total de proteínas con una movilidad electroforética que se corresponde con inmunoglobulina.

Las subclases de IgG y el contenido de Inmunoglobulina A (IgA) fueron cuantificadas mediante técnica de inmunodifusión radial comercial, IgG Subclass COMBI - SD RID (The Binding Site®), y Diffu-Plate Inmunoglobulina A (Argentina), respectivamente (método 2.7.1 FE).

La integridad del fragmento Fc de las Igs se evaluó de acuerdo al método 2.7.9 de FE, comparativamente con las preparaciones de referencia, Human Immunoglobulin BRP Code: H09990000 Batch 3 (función Fc intacta) y Human Immunoglobulin pepsin treated Code: DSP068 (Fc alterada).

Las hemaglutininas anti-A y anti-B, y los títulos de anti-D, fueron determinados por el método de aglutinación directo, de acuerdo a los métodos 2.6.20 y 2.6.26 de FE, respectivamente.

Determinación de anticuerpos específicos

La concentración de anticuerpos Anti Virus de la Hepatitis A (Anti-VHA), se evaluaron por un método de inmunoquimioluminiscencia según 2.6.26 de FE con el kit comercial de ARCHITECT HAVAb-lgG-ABBOTT (Abbott, Argentina).

La determinación de anticuerpos anti estreptolisina O (AELO) se realizó mediante una técnica in vitro de inhibición de la hemaglutinación con un kit comercial (Wiener Lab SAIC, Rosario, Argentina).

Control de ácido nucleico viral (ANv)

y marcadores virales

La seguridad de las Igs fueron evaluadas mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR in house) analizando la presencia del ANv del virus de la hepatitis C (VHC), de la inmunodeficiencia humana (VIH) y del virus de la hepatitis B (VHB)21-24.

Los marcadores serológicos, antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (AgHBs), anticuerpos contra VHC y anticuerpos contra VIH1/2, se analizaron por inmunoquimioluminiscencia con el kit comercial de ARCHITECT-ABBOTT, en minipooles de plasma y pool de partida (2.7.1 FE).

Estudios de trombogenicidad

Como pruebas globales de hemostasia se realizaron la determinación de trombina, midiendo el tiempo de coagulación de plasma normal (6 h a 37ºC y 24 h a t.a.), y de factores activados, empleando el Tiempo de Tromboplastina no-activado (NAPTT) según 2.6.22 de FE.

Además, se analizaron las cantidades residuales de factores II, VII y X de la coagulación con métodos coagulométricos en equipos ACL (Instrumentation Laboratory, Parsipany, USA), empleando el tiempo de protrombina (TP) y factores VIII, IX y XI, a través del tiempo de tromboplastina parcialmente activada (APTT)25. La actividad del factor XIa (FXIa) se determinó aplicando un método cromogénico (Biophen Hyphen Biomed, Francia).

Resultados

Los resultados de la caracterización in vitro de los 3 lotes de GAMMASUB UNC y de los 2 lotes de producto comercial se muestran en la Tabla 1, en la cual se informan los promedios ± desviación estándar de los parámetros analizados.

El título de hemaglutininas anti-A y anti-B fue 1/2 para los 3 lotes producidos en H-UNC y resultaron negativas para los 2 lotes del producto comercial, cumpliendo todas las preparaciones con el criterio de aceptación (< 1/64). Los títulos de anti-D fueron negativos para todas las muestras analizadas, tanto GAMMASUB UNC como comerciales.

La concentraciones de los factores de la coagulación residuales, que pueden generar trombogenicidad, fueron menores a los límites de detección de las técnicas utilizadas (Tabla 2). Sin embargo, cuando se midieron los niveles de FXI y FXIa, estos fueron detectables en los lotes de la preparación comercial pero no en los productos GAMMASUB UNC (Figura 2).

Los resultados de NAPTT en las muestras analizadas fueron mayores al criterio de aceptación (≥ 150 seg); a excepción de un lote de la preparación comercial que mostró tiempos de coagulación menores a 150 seg (Figura 3). No fue detectable la presencia de trombina en ninguna de las muestras, ya que no hubo coagulación en las condiciones estudiadas.

Los anticuerpos antivirales anti-VIH 1/2, anti-VHC y antígeno de superficie del VHB fueron negativos en todos los productos analizados, y los niveles de ANv por PCR resultaron no reactivos acorde a la sensibilidad de la técnica para cada virus en particular.

Los ensayos de toxicidad, esterilidad y pirógenos realizados en los lotes de GAMMASUB UNC, fueron satisfactorios, cumpliendo con los criterios de aceptación.

Conclusiones

En el estudio de caracterización de GAMMASUB UNC y del producto comercial de referencia, se detectaron atributos de calidad físicos, químicos y biológicos con características similares.

Se demostró que la molécula de IgG se conserva intacta y estable, en todas las preparaciones, a través de la integridad del fragmento Fc, analizadas frente a un estándar de referencia, favoreciendo la flexibilidad normal de la molécula para cumplir las funciones biológicas específicas.

La concentración y distribución de todas las subclases de IgG fueron similares a las detectadas en el plasma humano normal27.

La distribución molecular analizada por HPLC, demostró que GAMMASUB UNC y el producto comercial poseen el porcentaje de monómero más dímero y polímeros dentro de los criterios de aceptación definidos por FE, lo que evidencia la estabilidad de la molécula a través de los distintos pasos de purificación.

La concentración de anticuerpos Anti-VHA (≥100 UI/mL) en ambas formulaciones (GAMMASUB UNC y comercial) es suficiente para utilizarlas como profilaxis contra el virus de la hepatitis A.

La seguridad de los concentrados de IgG, con respecto a la transmisión de infecciones virales se pone de manifiesto mediante la ausencia de marcadores serológicos y de los ácidos nucleicos virales analizados por PCR in house, la cual es una consecuencia del control serológico realizado en el plasma de partida, de la incorporación de métodos de inactivación viral y del cumplimiento de las BPFyC durante su elaboración.

En los últimos años fueron informados eventos tromboembólicos relacionados a la administración intravenosa y/o subcutánea de concentrados de inmunoglobulinas humanas, los que estarían asociados a la presencia de sustancias procoagulantes, principalmente al FXIa. En la evaluación de estos parámetros, se detectó una mayor concentración del FXIa en el producto comercial con respecto a GAMMASUB UNC28.

La concentración de IgA en todas las formulaciones analizadas se encontró dentro de los criterios de aceptación previamente establecidos por el fabricante29.

Cabe destacar que GAMMASUB UNC posee un amplio espectro de anticuerpos, contra agentes infecciosos característicos de la región, lo que lo hace más recomendable en la profilaxis y terapéutica de infecciones severas y recurrentes tanto en niños como en adultos30,31. Además, se controlaron, esterilidad, pirógenos y seguridad en cobayos y ratones (FA 7ma Ed), para completar las especificaciones de calidad establecidas en H-UNC.

Los atributos de calidad analizados en el estudio de caracterización demostraron que el nuevo medicamento GAMMASUB UNC mantiene todas sus propiedades y funciones biológicas intactas, cumple con los requerimientos regulatorios nacionales e internacionales y es comparable al producto comercial utilizado como referencia32,33.

Agradecimientos

Al personal técnico del Área de Control de Calidad del Laboratorio de Hemoderivados UNC.

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Caracterización bioquímica de un preparado de gammaglobulina subcutánea

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